Alzheimerovej chorobe (AD) chýbajú proteínové biomarkery, ktoré odrážajú jej mnohonásobnú základnú patofyziológiu, čo bráni pokroku v diagnostike a liečbe. Tu používame komplexnú proteomiku na identifikáciu biomarkerov mozgovomiechového moku (CSF), ktoré predstavujú širokú škálu patofyziológie AD. Multiplexná hmotnostná spektrometria identifikovala približne 3 500 a približne 12 000 proteínov v AD CSF a mozgu. Sieťová analýza proteómu mozgu vyriešila 44 modulov biodiverzity, z ktorých 15 sa prekrývalo s proteómom cerebrospinálnej tekutiny. Značky CSF AD v týchto prekrývajúcich sa moduloch sú zložené do piatich proteínových skupín, ktoré predstavujú rôzne patofyziologické procesy. Synapsie a metabolity v mozgu AD klesajú, ale CSF sa zvyšuje, zatiaľ čo myelinizácia bohatá na gliové a imunitné skupiny v mozgu a CSF sa zvyšujú. Konzistencia a špecifickosť zmien panelu sa potvrdili vo viac ako 500 ďalších vzorkách CSF. Tieto skupiny tiež identifikovali biologické podskupiny pri asymptomatickej AD. Celkovo sú tieto výsledky sľubným krokom smerom k webovým biomarkerovým nástrojom pre klinické aplikácie pri AD.
Alzheimerova choroba (AD) je najčastejšou príčinou neurodegeneratívnej demencie na celom svete a je charakterizovaná širokou škálou dysfunkcií biologického systému, vrátane synaptického prenosu, imunity sprostredkovanej gliami a mitochondriálneho metabolizmu (1-3). Jeho zavedené proteínové biomarkery sa však stále zameriavajú na detekciu amyloidu a tau proteínu, a preto nemôžu odrážať túto rôznorodú patofyziológiu. Tieto „jadrové“ proteínové biomarkery, ktoré sa najspoľahlivejšie merajú v cerebrospinálnej tekutine (CSF), zahŕňajú (i) amyloid beta peptid 1-42 (Ap1-42), ktorý odráža tvorbu kortikálnych amyloidných plakov; (ii) celkový tau, znak degenerácie axónov; (iii) fosfo-tau (p-tau), predstaviteľ patologickej hyperfosforylácie tau (4-7). Hoci tieto biomarkery mozgovomiechového moku výrazne uľahčili detekciu „označených“ ochorení AD proteínov (4-7), predstavujú len malú časť komplexnej biológie, ktorá stojí za ochorením.
Nedostatok patofyziologickej diverzity biomarkerov AD viedol k mnohým výzvam, vrátane (i) neschopnosti identifikovať a kvantifikovať biologickú heterogenitu pacientov s AD, (ii) nedostatočného merania závažnosti a progresie ochorenia, najmä v predklinickom štádiu, a ( iii) vývoj terapeutických liečiv, ktoré nedokázali úplne vyriešiť všetky aspekty neurologického zhoršenia. Naša závislosť na prelomovej patológii pri opise AD z príbuzných chorôb tieto problémy len zhoršuje. Čoraz viac dôkazov ukazuje, že väčšina starších ľudí s demenciou má viac ako jednu patologickú charakteristiku poklesu kognitívnych funkcií (8). Až 90 % alebo viac jedincov s AD patológiou má tiež vaskulárne ochorenie, inklúzie TDP-43 alebo iné degeneratívne ochorenia (9). Tieto vysoké podiely patologického prekrývania narušili náš súčasný diagnostický rámec pre demenciu a je potrebná komplexnejšia patofyziologická definícia ochorenia.
Vzhľadom na naliehavú potrebu rôznych biomarkerov AD si oblasť čoraz viac osvojuje metódu „omics“ založenú na celkovom systéme na objavovanie biomarkerov. Aliancia Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance bola spustená v roku 2014 a je v popredí programu. Toto multidisciplinárne úsilie Národných inštitútov zdravia, akademickej obce a priemyslu sa zameriava na využitie systémových stratégií na lepšie definovanie patofyziológie AD a rozvoj diagnostickej analýzy biodiverzity a stratégií liečby (10). Ako súčasť tohto projektu sa sieťová proteomika stala sľubným nástrojom na rozvoj systémových biomarkerov v AD. Tento nezaujatý prístup založený na údajoch organizuje komplexné súbory proteomických údajov do skupín alebo „modulov“ spoločne exprimovaných proteínov, ktoré sú spojené so špecifickými typmi buniek, organelami a biologickými funkciami (11-13). Takmer 12 informačne bohatých sieťových proteomických štúdií bolo vykonaných na mozgu AD (13-23). Celkovo tieto analýzy naznačujú, že proteóm mozgovej siete AD si zachováva vysoko konzervatívnu modulárnu organizáciu v nezávislých kohortách a viacerých kortikálnych oblastiach. Okrem toho niektoré z týchto modulov vykazujú reprodukovateľné zmeny v hojnosti súvisiacej s AD v súboroch údajov, čo odráža patofyziológiu viacerých chorôb. Súhrnne tieto zistenia demonštrujú sľubný kotviaci bod pre objav proteómu mozgovej siete ako systémového biomarkera pri AD.
Aby sme transformovali proteóm mozgovej siete AD na klinicky užitočné biomarkery založené na systéme, skombinovali sme sieť odvodenú z mozgu s proteomickou analýzou AD CSF. Tento integrovaný prístup viedol k identifikácii piatich sľubných súborov biomarkerov CSF, ktoré sú spojené so širokou škálou patofyziológie založenej na mozgu, vrátane synapsií, krvných ciev, myelinizácie, zápalu a dysfunkcie metabolických dráh. Tieto panely biomarkerov sme úspešne overili prostredníctvom viacnásobných replikačných analýz, vrátane viac ako 500 vzoriek CSF z rôznych neurodegeneratívnych ochorení. Tieto validačné analýzy zahŕňajú skúmanie skupinových cieľov v CSF pacientov s asymptomatickou AD (AsymAD) alebo preukazovanie dôkazov abnormálnej akumulácie amyloidu v normálnom kognitívnom prostredí. Tieto analýzy zdôrazňujú významnú biologickú heterogenitu v populácii AsymAD a identifikujú panelové markery, ktoré môžu byť schopné podtypovať jednotlivcov v najskorších štádiách ochorenia. Celkovo tieto výsledky predstavujú kľúčový krok vo vývoji nástrojov proteínových biomarkerov založených na viacerých systémoch, ktoré môžu úspešne vyriešiť mnohé z klinických problémov, ktorým čelí AD.
Hlavným účelom tejto štúdie je identifikovať nové biomarkery mozgovomiechového moku, ktoré odrážajú rôzne mozgové patofyziológie, ktoré vedú k AD. Obrázok S1 načrtáva našu výskumnú metodológiu, ktorá zahŕňa (i) komplexnú analýzu založenú na predbežných zisteniach AD CSF a sieťového mozgového proteómu na identifikáciu viacerých biomarkerov ochorení CSF súvisiacich s mozgom a (ii) následnú replikáciu Tieto biomarkery sú v niekoľkých nezávislých cerebrospinálnych tekuté kohorty. Výskum zameraný na objavy sa začal analýzou diferenciálnej expresie CSF u 20 kognitívne normálnych jedincov a 20 pacientov s AD v Emory Goizueta Alzheimer's Disease Research Center (ADRC). Diagnóza AD je definovaná ako významná kognitívna porucha v prítomnosti nízkeho Aβ1-42 a zvýšených hladín celkového tau a p-tau v cerebrospinálnej tekutine [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA )]] (tabuľka S1A). Kontrola (priemerná MoCA, 26,7 ± 2,2) mala normálne hladiny biomarkerov CSF.
Ľudský CSF je charakterizovaný dynamickým rozsahom nadbytku proteínov, v ktorom albumín a iné mimoriadne hojné proteíny môžu brániť detekcii proteínov záujmu (24). Aby sme zvýšili hĺbku objavu proteínov, pred analýzou hmotnostnou spektrometriou (MS) sme z každej vzorky CSF odstránili prvých 14 vysoko hojných proteínov (24). Celkovo bolo pomocou MS identifikovaných 39 805 peptidov, ktoré boli mapované na 3691 proteómov v 40 vzorkách. Kvantifikácia proteínov sa uskutočňuje viacnásobným tandemovým hmotnostným značením (TMT) (18, 25). Aby sme vyriešili chýbajúce údaje, zahrnuli sme iba tie proteíny, ktoré boli kvantifikované v najmenej 50% vzoriek v následnej analýze, čím sme nakoniec kvantifikovali 2875 proteómov. Kvôli významnému rozdielu v hladinách celkového množstva bielkovín bola kontrolná vzorka štatisticky považovaná za odľahlú hodnotu (13) a nebola zahrnutá do následnej analýzy. Hodnoty abundancie zostávajúcich 39 vzoriek boli upravené podľa veku, pohlavia a kovariancie šarže (13-15, 17, 18, 20, 26).
Použitím štatistickej t-testovej analýzy na vyhodnotenie diferenciálnej expresie na súbore regresných údajov táto analýza identifikovala proteíny, ktorých hladiny hojnosti boli významne zmenené (P < 0,05) medzi kontrolnými prípadmi a prípadmi AD (tabuľka S2A). Ako je znázornené na obrázku 1A, početnosť celkovo 225 proteínov v AD bola významne znížená a početnosť 303 proteínov bola významne zvýšená. Tieto rozdielne exprimované proteíny zahŕňajú niekoľko predtým identifikovaných AD markerov cerebrospinálnej tekutiny, ako je proteín tau spojený s mikrotubulami (MAPT; P = 3,52 × 10-8), neurofilament (NEFL; P = 6,56 × 10-3), proteín súvisiaci s rastom 43 (GAP43; P = 1,46 x 10-5), proteín viažuci mastnú kyselinu 3 (FABP3; P = 2,00 x 10-5), chitináza 3 podobná 1 (CHI3L1; P = 4,44 x 10-6), nervový granululín (NRGN; P = 3,43 × 10-4) a nervový rastový faktor VGF (VGF; P = 4,83 × 10-3) (4-6). Identifikovali sme však aj ďalšie veľmi dôležité ciele, ako je inhibítor disociácie GDP 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) a modulárne viazanie vápnika súvisiace so SPARC 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). Analýza génovej ontológie (GO) 225 významne redukovaných proteínov odhalila úzke spojenie s procesmi telesných tekutín, ako je metabolizmus steroidov, koagulácia krvi a hormonálna aktivita (obrázok 1B a tabuľka S2B). Naproti tomu výrazne zvýšený proteín 303 úzko súvisí s bunkovou štruktúrou a energetickým metabolizmom.
(A) Graf sopky ukazuje log2-násobok zmeny (os x) vzhľadom na -log10 štatistickú hodnotu P (os y) získanú t-testom, ktorý sa používa na detekciu rozdielnej expresie medzi kontrolou (CT) a AD prípady CSF proteómu všetkých proteínov. Proteíny s výrazne zníženými hladinami (P <0,05) pri AD sú znázornené modrou, zatiaľ čo proteíny s výrazne zvýšenými hladinami pri chorobe sú znázornené červenou farbou. Vybraný proteín je označený. (B) Najvyššie termíny GO súvisiace s proteínom sú výrazne znížené (modré) a zvýšené (červené) pri AD. Zobrazuje tri výrazy GO s najvyšším z-skóre v oblasti biologických procesov, molekulárnych funkcií a bunkových komponentov. (C) MS merala hladinu MAPT vo vzorke CSF (vľavo) a jej koreláciu s hladinou tau vzorky ELISA (vpravo). Zobrazí sa Pearsonov korelačný koeficient s príslušnou hodnotou P. Kvôli nedostatku údajov ELISA pre jeden prípad AD tieto čísla zahŕňajú hodnoty pre 38 z 39 analyzovaných prípadov. (D) Kontrolovaná klastrová analýza (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) upravená P <0,01) na kontrole a AD CSF našli vzorky s použitím 65 najvýznamnejšie zmenených proteínov v súbore údajov. Normalizovať, normalizovať.
Proteomická hladina MAPT úzko súvisí s nezávisle nameranou hladinou tau ELISA (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; obrázok 1C), čo podporuje platnosť nášho merania MS. Po štiepení trypsínom na úrovni amyloidového prekurzorového proteínu (APP) nie je možné izoformne špecifické peptidy mapované na C-koniec Ap1-40 a Ap1-42 efektívne ionizovať (27, 28). Preto APP peptidy, ktoré sme identifikovali, nemajú nič spoločné s hladinami ELISA Apl-42. Aby sme vyhodnotili rozdielnu expresiu každého prípadu, použili sme rozdielne exprimované proteíny s P <0,0001 [miera falošného objavu (FDR) korigovaná P <0,01], aby sme vykonali kontrolovanú zhlukovú analýzu vzoriek (tabuľka S2A). Ako je znázornené na obrázku 1D, týchto 65 vysoko významných proteínov môže správne zoskupovať vzorky podľa stavu ochorenia, s výnimkou jedného prípadu AD s charakteristikami podobnými kontrole. Z týchto 65 proteínov sa 63 zvýšilo v AD, zatiaľ čo iba dva (CD74 a ISLR) sa znížili. Celkovo tieto analýzy cerebrospinálnej tekutiny identifikovali stovky proteínov v AD, ktoré môžu slúžiť ako biomarkery ochorenia.
Potom sme vykonali nezávislú sieťovú analýzu proteómu mozgu AD. Mozgová kohorta tohto objavu zahŕňala dorzolaterálny prefrontálny kortex (DLPFC) z kontroly (n = 10), prípady Parkinsonovej choroby (PD; n = 10), zmiešané prípady AD/PD (n = 10) a AD (n = 10). ) Vzorka. Emery Goizueta ADRC. Demografia týchto 40 prípadov už bola opísaná (25) a sú zhrnuté v tabuľke S1B. Na analýzu týchto 40 mozgových tkanív a replikačnej kohorty 27 prípadov sme použili TMT-MS. Celkovo tieto dva súbory údajov o mozgu vyprodukovali 227 121 jedinečných peptidov, ktoré boli mapované na 12 943 proteómov (25). Do následných výskumov boli zahrnuté len tie proteíny, ktoré boli kvantifikované aspoň v 50 % prípadov. Konečný súbor údajov o objave obsahuje 8817 kvantifikovaných proteínov. Upravte hladiny proteínov na základe veku, pohlavia a post-mortem intervalu (PMI). Analýza diferenciálnej expresie súboru údajov po regresii ukázala, že >2000 hladín proteínov sa významne zmenilo [P <0,05, analýza rozptylu (ANOVA)] v dvoch alebo viacerých kohortách chorôb. Potom sme vykonali kontrolovanú zhlukovú analýzu založenú na rozdielne exprimovaných proteínoch a P < 0,0001 v porovnaní AD / kontrola a / alebo AD / PD (obrázok S2, A a B, tabuľka S2C). Týchto 165 vysoko zmenených proteínov jasne zobrazuje prípady s AD patológiou z kontrolných a PD vzoriek, čo potvrdzuje silné AD-špecifické zmeny v celom proteóme.
Potom sme použili algoritmus s názvom Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) na vykonanie sieťovej analýzy na objavenom mozgovom proteóme, ktorý organizuje súbor údajov do proteínových modulov s podobnými vzormi expresie (11-13). Analýza identifikovala 44 modulov (M) koexprimovaných proteínov, triedených a očíslovaných od najväčšieho (M1, n = 1821 proteínov) po najmenšie (M44, n = 34 proteínov) (obrázok 2A a tabuľka S2D)). Ako je uvedené vyššie (13) Vypočítajte reprezentatívny profil expresie alebo charakteristický proteín každého modulu a korelujte ho so stavom ochorenia a patológiou AD, to znamená, vytvorte alianciu registra Alzheimerovej choroby (CERAD) a Braakova skóre (obrázok 2B). Celkovo 17 modulov významne súviselo s neuropatológiou AD (P <0,05). Mnohé z týchto modulov súvisiacich s ochorením sú tiež bohaté na markery špecifické pre bunkový typ (obrázok 2B). Ako je uvedené vyššie (13), obohatenie bunkového typu sa určuje analýzou prekrývania modulov a referenčného zoznamu génov špecifických pre bunkový typ. Tieto gény sú odvodené z publikovaných údajov v izolovaných myších neurónoch, endotelových a gliových bunkách. Experiment sekvenovania RNA (RNA-seq) (29).
(A) Objavte WGCNA proteómu mozgu. (B) Analýza biweight midcorrelation (BiCor) modulárneho signatúrneho proteínu (prvá hlavná zložka expresie modulárneho proteínu) s neuropatologickými charakteristikami AD (hore), vrátane skóre CERAD (Ap plak) a Braak (tau tangles). Intenzity pozitívnych (červená) a negatívnych (modrá) korelácií sú znázornené dvojfarebnou tepelnou mapou a hviezdičky označujú štatistickú významnosť (P <0,05). Použite Hypergeometrický Fisherov presný test (FET) (dole) na posúdenie asociácie typu buniek každého proteínového modulu. Intenzita červeného tieňovania označuje stupeň obohatenia bunkového typu a hviezdička označuje štatistickú významnosť (P <0,05). Na opravu hodnoty P odvodenej z FET použite metódu BH. (C) GO analýza modulárnych proteínov. Najbližšie súvisiace biologické procesy sú zobrazené pre každý modul alebo súvisiacu skupinu modulov. oligo, oligodendrocyt.
Súbor piatich úzko súvisiacich modulov bohatých na astrocyty a mikroglie (M30, M29, M18, M24 a M5) vykazoval silnú pozitívnu koreláciu s neuropatológiou AD (obrázok 2B). Ontologická analýza spája tieto gliové moduly s bunkovým rastom, proliferáciou a imunitou (obrázok 2C a tabuľka S2E). Dva ďalšie gliové moduly, M8 a M22, sú tiež silne upregulované pri chorobe. M8 vysoko súvisí s Toll-like receptorovou dráhou, signálnou kaskádou, ktorá hrá kľúčovú úlohu vo vrodenej imunitnej odpovedi (30). Zároveň M22 úzko súvisí s posttranslačnou modifikáciou. M2, ktorý je bohatý na oligodendrocyty, vykazuje silnú pozitívnu koreláciu s patológiou AD a ontologické spojenie so syntézou nukleozidov a replikáciou DNA, čo naznačuje zvýšenú proliferáciu buniek pri chorobách. Celkovo tieto zistenia podporujú zvýšenie gliových modulov, ktoré sme predtým pozorovali v proteóme siete AD (13, 17). V súčasnosti sa zistilo, že mnohé gliové moduly súvisiace s AD v sieti vykazujú nižšie hladiny expresie v kontrolných a PD prípadoch, čo zdôrazňuje ich špecifickosť ochorenia, ktorá je zvýšená pri AD (obrázok S2C).
Iba štyri moduly v našom sieťovom proteóme (M1, M3, M10 a M32) silne negatívne korelujú s patológiou AD (P <0,05) (obrázok 2, B a C). M1 aj M3 sú bohaté na neurónové markery. M1 vysoko súvisí so synaptickými signálmi, zatiaľ čo M3 úzko súvisí s mitochondriálnou funkciou. Neexistuje žiadny dôkaz o obohatení bunkového typu pre M10 a M32. M32 odráža spojenie medzi M3 a bunkovým metabolizmom, zatiaľ čo M10 úzko súvisí s rastom buniek a funkciou mikrotubulov. V porovnaní s AD sú všetky štyri moduly zvýšené v kontrole a PD, čo im dáva zmeny AD špecifické pre chorobu (obrázok S2C). Celkovo tieto výsledky podporujú znížené množstvo modulov bohatých na neuróny, ktoré sme predtým pozorovali pri AD (13, 17). Stručne povedané, sieťová analýza proteómu mozgu, ktorú sme objavili, priniesla AD-špecificky zmenené moduly v súlade s našimi predchádzajúcimi zisteniami.
AD je charakterizovaná skorým asymptomatickým štádiom (AsymAD), v ktorom jednotlivci vykazujú akumuláciu amyloidu bez klinického poklesu kognitívnych funkcií (5, 31). Toto asymptomatické štádium predstavuje kritické okno pre včasnú detekciu a intervenciu. Už predtým sme preukázali silné modulárne zachovanie proteómu mozgovej siete AsymAD a AD v nezávislých súboroch údajov (13, 17). Aby sme sa uistili, že mozgová sieť, ktorú sme v súčasnosti objavili, je v súlade s týmito predchádzajúcimi zisteniami, analyzovali sme zachovanie 44 modulov v replikovanom súbore údajov od 27 organizácií DLPFC. Tieto organizácie zahŕňajú prípady kontroly (n = 10), AsymAD (n = 8) a AD (n = 9). Kontrolné a AD vzorky boli zahrnuté do analýzy našej objavenej mozgovej kohorty (tabuľka S1B), zatiaľ čo prípady AsymAD boli jedinečné iba v replikačnej kohorte. Tieto prípady AsymAD tiež pochádzali z mozgovej banky Emory Goizueta ADRC. Hoci kognícia bola v čase smrti normálna, hladiny amyloidu boli abnormálne vysoké (priemer CERAD, 2,8 ± 0,5) (tabuľka S1B).
Analýza TMT-MS týchto 27 mozgových tkanív viedla ku kvantifikácii 11 244 proteómov. Tento konečný počet zahŕňa iba proteíny kvantifikované v najmenej 50 % vzoriek. Tento replikovaný súbor údajov obsahuje 8 638 (98,0 %) z 8 817 proteínov zistených v našej objavnej analýze mozgu a má takmer 3 000 významne zmenených proteínov medzi kontrolnou a AD kohortou (P < 0,05, po Tukeyho párovom t teste na analýzu rozptylu) ( Tabuľka S2F). Medzi týmito rozdielne exprimovanými proteínmi 910 tiež vykazoval významné zmeny hladiny medzi prípadmi AD a kontrolnými prípadmi proteómu mozgu (P <0,05, po párovom t-teste ANOVA Tukey). Stojí za zmienku, že tieto 910 markery sú vysoko konzistentné v smere zmeny medzi proteómami (r = 0, 94, P < 1, 0 × 10-200) (obrázok S3A). Medzi zvýšenými proteínmi sú proteíny s najkonzistentnejšími zmenami medzi súbormi údajov hlavne členmi modulov M5 a M18 bohatých na gliové bunky (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 a GFAP). Medzi redukovanými proteínmi boli tie s najkonzistentnejšími zmenami takmer výlučne členmi modulu M1 (NPTX2, VGF a RPH3A) spojeného so synapsiou. Ďalej sme overili zmeny midkinu (MDK), CD44, vylučovaného proteínu 1 súvisiaceho s krepovatením (SFRP1) a VGF súvisiace s AD pomocou westernového prenosu (obrázok S3B). Analýza zachovania modulu ukázala, že približne 80 % proteínových modulov (34/44) v mozgovom proteóme bolo významne zachovaných v súbore údajov replikácie (z-skóre> 1,96, FDR korigované P <0,05) (obrázok S3C). Štrnásť z týchto modulov bolo špeciálne rezervovaných medzi dvoma proteómami (z-skóre> 10, FDR korigované P <1,0 × 10-23). Celkovo objav a replikácia vysokého stupňa konzistencie v diferenciálnej expresii a modulárnom zložení medzi mozgovým proteómom zdôrazňuje reprodukovateľnosť zmien v proteínoch frontálnej kôry AD. Okrem toho tiež potvrdil, že AsymAD a pokročilejšie ochorenia majú veľmi podobnú štruktúru mozgovej siete.
Podrobnejšia analýza diferenciálnej expresie v súbore údajov replikácie mozgu poukazuje na významný stupeň zmien proteínu AsymAD, vrátane celkovo 151 významne zmenených proteínov medzi AsymAD a kontrolou (P <0, 05) (obrázok S3D). V súlade s amyloidovou záťažou sa APP v mozgu AsymAD a AD významne zvýšil. MAPT sa významne mení iba pri AD, čo je v súlade so zvýšenými hladinami spleti a jeho známou koreláciou s kognitívnym poklesom (5, 7). Moduly bohaté na gliové bunky (M5 a M18) sa vysoko odrážajú vo zvýšených proteínoch v AsymAD, zatiaľ čo modul M1 súvisiaci s neurónmi je najreprezentatívnejším zo znížených proteínov v AsymAD. Mnohé z týchto markerov AsymAD vykazujú väčšie zmeny v symptomatických ochoreniach. Medzi týmito markermi je SMOC1, gliový proteín patriaci do M18, ktorý je spojený s nádormi mozgu a vývojom očí a končatín (32). MDK je rastový faktor viažuci heparín súvisiaci s bunkovým rastom a angiogenézou (33), ďalší člen M18. V porovnaní s kontrolnou skupinou sa AsymAD výrazne zvýšil, po čom nasledoval väčší nárast AD. Naopak, synaptický proteín neuropentraxín 2 (NPTX2) bol v mozgu AsymAD významne znížený. NPTX2 bol predtým spojený s neurodegeneráciou a má uznávanú úlohu pri sprostredkovaní excitačných synapsií (34). Celkovo tieto výsledky odhaľujú množstvo rôznych predklinických proteínových zmien pri AD, ktoré zrejme progredujú so závažnosťou ochorenia.
Vzhľadom na to, že sme pri objavení mozgového proteómu dosiahli značnú hĺbku pokrytia proteínmi, snažíme sa lepšie pochopiť jeho prekrytie s transkriptómom AD na úrovni siete. Preto sme porovnali mozgový proteóm, ktorý sme objavili, s modulom, ktorý sme predtým vygenerovali z mikročipového merania 18 204 génov v AD (n = 308) a kontrolných (n = 157) DLPFC tkanivách (13). prekrývajúce sa. Celkovo sme identifikovali 20 rôznych modulov RNA, z ktorých mnohé demonštrovali obohatenie špecifických typov buniek vrátane neurónov, oligodendrocytov, astrocytov a mikroglií (obrázok 3A). Viacnásobné zmeny týchto modulov v AD sú znázornené na obrázku 3B. V súlade s našou predchádzajúcou analýzou prekrývania proteín-RNA s použitím hlbšieho neznačeného proteómu MS (asi 3 000 proteínov) (13), väčšina zo 44 modulov v sieti mozgových proteómov, ktoré sme našli, sa nachádza v sieti transkriptómov. Neexistuje žiadne významné prekrytie. náš objav a replikácia 34 proteínových modulov, ktoré sú vysoko zadržané v proteóme mozgu, iba 14 (~ 40 %) prešlo Fisherovým presným testom (FET), preukázalo sa, že má štatisticky významné prekrytie s transkriptómom (obrázok 3A). Kompatibilné s opravou poškodenia DNA (P-M25 a P-M19), transláciou proteínov (P-M7 a P-M20), väzbou/zostrihom RNA (P-M16 a P-M21) a zacielením na proteín (P-M13 a P- M23) sa neprekrýva s modulmi v prepise. Preto, aj keď sa v súčasnej analýze prekrývania používa hlbší súbor údajov o proteóme (13), väčšina proteómu siete AD nie je namapovaná na sieť transkriptómov.
(A) Hypergeometrický FET demonštruje obohatenie markerov špecifických pre bunkový typ v module RNA transkriptómu AD (hore) a stupeň prekrývania medzi modulmi RNA (os x) a proteínmi (os y) mozgu AD (dole) . Intenzita červeného tieňovania udáva stupeň obohatenia typov buniek v hornom paneli a intenzitu prekrývania modulov v spodnom paneli. Hviezdičky označujú štatistickú významnosť (P <0,05). (B) Stupeň korelácie medzi charakteristickými génmi každého transkriptómového modulu a stavom AD. Moduly vľavo najviac negatívne korelujú s AD (modrá) a moduly vpravo najpozitívnejšie korelujú s AD (červená). Log-transformovaná BH-korigovaná hodnota P indikuje stupeň štatistickej významnosti každej korelácie. (C) Významné prekrývajúce sa moduly so zdieľaným obohatením typu buniek. (D) Korelačná analýza log2-násobnej zmeny značeného proteínu (os x) a RNA (os y) v prekrývajúcom sa module. Zobrazí sa Pearsonov korelačný koeficient s príslušnou hodnotou P. mikro, mikroglie; nebeské telesá, astrocyty. CT, kontrola.
Väčšina prekrývajúcich sa proteínových a RNA modulov zdieľa podobné profily obohatenia bunkového typu a konzistentné smery zmeny AD (obrázok 3, B a C). Inými slovami, modul M1 mozgového proteómu súvisiaci so synapsiou (PM1) je mapovaný na tri homológne moduly RNA bohaté na neuróny (R-M1, R-M9 a R-M16), ktoré sú v AD Oba znížená úroveň. Podobne sa proteínové moduly M5 a M18 bohaté na gliové bunky prekrývajú s modulmi RNA bohatými na astrocyty a mikrogliálne markery (R-M3, R-M7 a R-M10) a vo veľkej miere sa podieľajú na náraste ochorení. Tieto zdieľané modulárne funkcie medzi týmito dvoma súbormi údajov ďalej podporujú obohatenie bunkového typu a zmeny súvisiace s ochorením, ktoré sme pozorovali v proteóme mozgu. V týchto zdieľaných moduloch sme však pozorovali veľa významných rozdielov medzi hladinami RNA a proteínov jednotlivých markerov. Korelačná analýza rozdielnej expresie proteomiky a transkriptomiky molekúl v rámci týchto prekrývajúcich sa modulov (obrázok 3D) zdôrazňuje túto nekonzistentnosť. Napríklad APP a niekoľko ďalších proteínov gliového modulu (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 a SFRP1) vykazovali významné zvýšenie proteómu AD, ale v transkriptóme AD nedošlo takmer k žiadnej zmene. Tieto zmeny špecifické pre proteín môžu úzko súvisieť s amyloidnými plakmi (23, 35), čo zvýrazňuje proteóm ako zdroj patologických zmien a tieto zmeny sa nemusia prejaviť v transkriptóme.
Po nezávislej analýze proteómov mozgu a CSF, ktoré sme objavili, sme vykonali komplexnú analýzu dvoch súborov údajov, aby sme identifikovali biomarkery AD CSF súvisiace s patofyziológiou mozgovej siete. Najprv musíme definovať prekrytie dvoch proteómov. Hoci sa všeobecne uznáva, že CSF odráža neurochemické zmeny v mozgu AD (4), presný stupeň prekrývania medzi mozgom AD a proteómom CSF nie je jasný. Porovnaním počtu zdieľaných génových produktov detegovaných v našich dvoch proteómoch sme zistili, že takmer 70 % (n = 1936) proteínov identifikovaných v mozgovomiechovom moku bolo kvantifikovaných aj v mozgu (obrázok 4A). Väčšina z týchto prekrývajúcich sa proteínov (n = 1721) je mapovaná na jeden zo 44 koexpresných modulov zo súboru údajov o mozgu objavu (obrázok 4B). Ako sa očakávalo, šesť najväčších mozgových modulov (M1 až M6) vykazovalo najväčšie prekrytie CSF. Existujú však menšie mozgové moduly (napríklad M15 a M29), ktoré dosahujú neočakávane vysoký stupeň prekrytia, väčšie ako mozgový modul, ktorý je dvakrát väčší. To nás motivuje prijať podrobnejšiu, štatisticky riadenú metódu na výpočet prekrývania medzi mozgom a cerebrospinálnou tekutinou.
(A a B) Proteíny zistené v súboroch údajov z objaveného mozgu a CSF sa prekrývajú. Väčšina týchto prekrývajúcich sa proteínov je spojená s jedným zo 44 koexpresných modulov mozgovej koexpresnej siete. (C) Objavte prekrytie medzi proteómom mozgovomiechového moku a proteómom mozgovej siete. Každý riadok tepelnej mapy predstavuje samostatnú analýzu prekrývania hypergeometrického FET. Horný riadok zobrazuje prekrytie (sivé/čierne tieňovanie) medzi mozgovým modulom a celým proteómom CSF. Druhá čiara znázorňuje, že prekrytie medzi mozgovými modulmi a proteínom CSF (vytieňované červenou farbou) je významne upregulované pri AD (P <0,05). Tretí riadok ukazuje, že prekrytie medzi mozgovými modulmi a proteínom CSF (modré tieňovanie) je významne znížené pri AD (P <0, 05). Na opravu hodnoty P odvodenej z FET použite metódu BH. (D) Panel skladacieho modulu na základe asociácie typu bunky a súvisiacich podmienok GO. Tieto panely obsahujú celkovo 271 proteínov súvisiacich s mozgom, ktoré majú zmysluplnú diferenciálnu expresiu v proteóme CSF.
Pomocou jednostranných FET sme hodnotili dôležitosť prekrývania proteínov medzi proteómom CSF a jednotlivými modulmi mozgu. Analýza odhalila, že celkovo 14 mozgových modulov v súbore údajov CSF má štatisticky významné prekrytia (FDR upravené P <0,05) a ďalší modul (M18), ktorého prekrytie je blízko významnosti (FDR upravené P = 0,06) (obrázok 4C , horný riadok). Zaujímajú nás tiež moduly, ktoré sa silne prekrývajú s odlišne exprimovanými CSF proteínmi. Preto sme použili dve ďalšie analýzy FET, aby sme určili, ktorý z (i) proteín CSF bol významne zvýšený pri AD a (ii) proteín CSF bol významne znížený pri AD (P <0,05, párový t test AD/kontrola) Moduly mozgu so zmysluplným prekrývaním medzi nimi. Ako je znázornené v strednom a spodnom riadku obrázku 4C, tieto dodatočné analýzy ukazujú, že 8 zo 44 mozgových modulov sa výrazne prekrýva s proteínom pridaným do AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 a M38) . ), zatiaľ čo iba dva moduly (M6 a M15) vykazovali zmysluplné prekrytie s redukovaným proteínom v AD CSF. Ako sa očakávalo, všetkých 10 modulov je v 15 moduloch s najvyšším prekrytím s proteómom CSF. Preto predpokladáme, že týchto 15 modulov sú vysoko výnosné zdroje biomarkerov CSF odvodených z mozgu AD.
Týchto 15 prekrývajúcich sa modulov sme zložili do piatich veľkých proteínových panelov na základe ich blízkosti v stromovom diagrame WGCNA a ich asociácie s typmi buniek a génovou ontológiou (obrázok 4D). Prvý panel obsahuje moduly bohaté na neurónové markery a proteíny súvisiace so synapsiou (M1 a M12). Synaptický panel obsahuje celkovo 94 proteínov a hladiny v proteóme CSF sa výrazne zmenili, čo z neho robí najväčší zdroj markerov CSF súvisiacich s mozgom spomedzi piatich panelov. Druhá skupina (M6 a M15) preukázala úzke spojenie s markermi endotelových buniek a cievnym telom, ako je „hojenie rán“ (M6) a „regulácia humorálnej imunitnej odpovede“ (M15). M15 tiež vysoko súvisí s metabolizmom lipoproteínov, ktorý úzko súvisí s endotelom (36). Cievny panel obsahuje 34 CSF markerov súvisiacich s mozgom. Tretia skupina zahŕňa moduly (M2 a M4), ktoré významne súvisia s oligodendrocytovými markermi a bunkovou proliferáciou. Napríklad najvyššie ontologické pojmy M2 zahŕňajú „pozitívnu reguláciu replikácie DNA“ a „proces biosyntézy purínov“. Medzitým tie z M4 zahŕňajú „diferenciáciu gliových buniek“ a „segregáciu chromozómov“. Panel myelinizácie obsahuje 49 markerov CSF súvisiacich s mozgom.
Štvrtá skupina obsahuje najviac modulov (M30, M29, M18, M24 a M5) a takmer všetky moduly sú výrazne bohaté na mikrogliové a astrocytové markery. Podobne ako myelinizačný panel aj štvrtý panel obsahuje moduly (M30, M29 a M18), ktoré úzko súvisia s bunkovou proliferáciou. Ostatné moduly v tejto skupine úzko súvisia s imunologickými pojmami, ako napríklad „proces imunitného účinku“ (M5) a „regulácia imunitnej odpovede“ (M24). Gliová imunitná skupina obsahuje 42 CSF markerov súvisiacich s mozgom. Nakoniec posledný panel obsahuje 52 markerov súvisiacich s mozgom na štyroch moduloch (M44, M3, M33 a M38), z ktorých všetky sú na tele súvisiace so skladovaním energie a metabolizmom. Najväčší z týchto modulov (M3) úzko súvisí s mitochondriami a je bohatý na neurónovo špecifické markery. M38 je jedným z menších členov modulu v tomto metabolóme a tiež vykazuje strednú neurónovú špecifickosť.
Celkovo týchto päť panelov odráža širokú škálu typov buniek a funkcií v kôre AD a spoločne obsahuje 271 markerov CSF súvisiacich s mozgom (tabuľka S2G). Aby sme vyhodnotili platnosť týchto výsledkov MS, použili sme test proximitného rozšírenia (PEA), technológiu založenú na ortogonálnych protilátkach s multiplexnými schopnosťami, vysokou citlivosťou a špecifickosťou, a znovu sme analyzovali vzorky cerebrospinálnej tekutiny, ktorú sme našli podskupinu týchto 271 biomarkerov. (n = 36). Týchto 36 cieľov demonštruje zmenu v AD násobku PEA, ktorá úzko súvisí s našimi zisteniami založenými na MS (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), čo silne overilo výsledky našej komplexnej analýzy MS (obrázok S4 ).
Biologické témy zdôraznené našimi piatimi skupinami, od synaptickej signalizácie po energetický metabolizmus, všetky súvisia s patogenézou AD (1-3). Preto všetkých 15 modulov obsahujúcich tieto panely súvisí s patológiou AD v proteóme mozgu, ktorú sme objavili (obrázok 2B). Najpozoruhodnejšia je vysoká pozitívna patologická korelácia medzi našimi gliovými modulmi a silná negatívna patologická korelácia medzi našimi najväčšími neurónovými modulmi (M1 a M3). Analýza diferenciálnej expresie nášho replikovaného mozgového proteómu (obrázok S3D) tiež zdôrazňuje gliové proteíny odvodené od M5 a M18. Pri AsymAD a symptomatickej AD sú najviac zvýšené gliové proteíny a synapsie súvisiace s M1. Proteín je najviac znížený. Tieto pozorovania naznačujú, že 271 markerov cerebrospinálnej tekutiny, ktoré sme identifikovali v piatich skupinách, súvisí s chorobnými procesmi v kôre AD, vrátane tých, ktoré sa vyskytujú v skorých asymptomatických štádiách.
Aby sme lepšie analyzovali smer zmeny panelových proteínov v mozgu a miechovej tekutine, nakreslili sme pre každý z 15 prekrývajúcich sa modulov nasledovné: (i) našli sme úroveň množstva modulov v súbore údajov o mozgu a (ii) modul proteín Rozdiel je vyjadrený v cerebrospinálnom moku (obrázok S5). Ako už bolo spomenuté, WGCNA sa používa na určenie množstva modulov alebo charakteristickej hodnoty proteínu v mozgu (13). Sopečná mapa sa používa na opis diferenciálnej expresie modulárnych proteínov v cerebrospinálnej tekutine (AD/kontrola). Tieto čísla ukazujú, že tri z piatich panelov ukazujú rôzne trendy expresie v mozgu a mieche. Dva moduly panela synapsií (M1 a M12) vykazujú zníženie úrovne hojnosti v mozgu AD, ale výrazne sa prekrývajú so zvýšeným proteínom v AD CSF (obrázok S5A). Moduly súvisiace s neurónmi obsahujúce metabolóm (M3 a M38) vykazovali podobné nekonzistentné vzorce expresie mozgu a mozgovomiechového moku (obrázok S5E). Cievny panel tiež vykazoval rôzne trendy expresie, hoci jeho moduly (M6 a M15) boli mierne zvýšené v mozgu AD a znížené v chorom CSF (obrázok S5B). Zostávajúce dva panely obsahujú veľké gliové siete, ktorých proteíny sú v oboch kompartmentoch dôsledne upregulované (obrázok S5, C a D).
Upozorňujeme, že tieto trendy nie sú spoločné pre všetky značky v týchto paneloch. Napríklad synaptický panel obsahuje niekoľko proteínov, ktoré sú významne znížené v mozgu AD a CSF (obrázok S5A). Medzi týmito down-regulovanými markermi cerebrospinálnej tekutiny sú NPTX2 a VGF z M1 a chromogranín B z M12. Napriek týmto výnimkám je však väčšina našich synaptických markerov zvýšená v miechovej tekutine AD. Celkovo boli tieto analýzy schopné rozlíšiť štatisticky významné trendy v hladinách mozgu a mozgovomiechovej tekutiny v každom z našich piatich panelov. Tieto trendy zdôrazňujú zložitý a často odlišný vzťah medzi expresiou proteínov v mozgu a CSF pri AD.
Potom sme použili vysokovýkonnú analýzu replikácie MS (replikácia CSF 1), aby sme zúžili našu 271 sadu biomarkerov na najsľubnejšie a reprodukovateľné ciele (obrázok 5A). Kópia 1 CSF obsahuje celkovo 96 vzoriek z Emory Goizueta ADRC, vrátane kontroly, AsymAD a kohorty AD (tabuľka S1A). Tieto prípady AD sú charakterizované miernym kognitívnym poklesom (priemerná hodnota MoCA, 20,0 ± 3,8) a zmenami v biomarkeroch AD potvrdenými v mozgovomiechovom moku (tabuľka S1A). Na rozdiel od analýzy CSF, ktorú sme zistili, sa táto replikácia vykonáva pomocou efektívnejšej a výkonnejšej „jednorazovej“ MS metódy (bez off-line frakcionácie), vrátane zjednodušeného protokolu prípravy vzorky, ktorý eliminuje potrebu imunodeplécie jednotlivých vzoriek. . Namiesto toho sa na zosilnenie signálu menej hojných proteínov používa jeden „kanál na zlepšenie“ s vyčerpanou imunitou (37). Aj keď znižuje celkové pokrytie proteómom, táto jednorazová metóda výrazne znižuje strojový čas a zvyšuje počet vzoriek označených TMT, ktoré možno analyzovať ako životaschopné (17, 38). Celkovo analýza identifikovala 6 487 peptidov, ktoré sa zmapovali na 1 183 proteómov v 96 prípadoch. Rovnako ako pri analýze CSF, ktorú sme zistili, do následných výpočtov boli zahrnuté iba tie proteíny kvantifikované v najmenej 50% vzoriek a údaje boli regresované pre účinky veku a pohlavia. To viedlo ku konečnej kvantifikácii 792 proteómov, z ktorých 95 % bolo tiež identifikovaných v nájdenom súbore údajov CSF.
(A) Proteínové ciele CSF súvisiace s mozgom overené v prvej replikovanej kohorte CSF a zahrnuté v konečnom paneli (n = 60). (B až E) Panelové hladiny biomarkerov (zložené z-skóre) merané v štyroch replikačných kohortách CSF. Párové t-testy alebo ANOVA s Tukeyho post-korekciou sa použili na vyhodnotenie štatistickej významnosti zmien v abundancii v každej replikačnej analýze. CT, kontrola.
Keďže nás obzvlášť zaujíma overenie našich 271 cieľov CSF súvisiacich s mozgom prostredníctvom komplexnej analýzy, obmedzíme ďalšie skúmanie tohto replikovaného proteómu na tieto markery. Spomedzi týchto 271 proteínov bolo 100 detegovaných v CSF replikácii 1. Obrázok S6A ukazuje rozdielnu expresiu týchto 100 prekrývajúcich sa markerov medzi kontrolnými vzorkami a vzorkami replikácie AD. Synaptické a metabolitové históny sa najviac zvyšujú pri AD, zatiaľ čo vaskulárne proteíny sa najviac znižujú pri ochorení. Väčšina zo 100 prekrývajúcich sa markerov (n = 70) si zachovala rovnaký smer zmeny v dvoch súboroch údajov (obrázok S6B). Týchto 70 validovaných markerov CSF súvisiacich s mozgom (tabuľka S2H) do značnej miery odráža skôr pozorované trendy panelovej expresie, to znamená down-reguláciu vaskulárnych proteínov a up-reguláciu všetkých ostatných panelov. Iba 10 z týchto 70 overených proteínov vykazovalo zmeny v abundancii AD, ktoré boli v rozpore s týmito panelovými trendmi. Aby sme vytvorili panel, ktorý najlepšie odráža celkový trend mozgu a mozgovomiechového moku, vylúčili sme týchto 10 proteínov z panelu záujmu, ktorý sme nakoniec overili (obrázok 5A). Náš panel preto v konečnom dôsledku zahŕňa celkovo 60 proteínov overených v dvoch nezávislých kohortách CSF AD s použitím rôznych príprav vzoriek a analýzy platformy MS. Grafy expresie z-skóre týchto konečných panelov v kontrole CSF kópie 1 a prípadoch AD potvrdili panelový trend pozorovaný v kohorte CSF, ktorú sme našli (obrázok 5B).
Medzi týmito 60 proteínmi sú molekuly, o ktorých je známe, že sú spojené s AD, ako napríklad osteopontín (SPP1), čo je prozápalový cytokín, ktorý sa spája s AD v mnohých štúdiách (39-41), a GAP43, synaptický proteín ktorý je jasne spojený s neurodegeneráciou (42). Najviac overenými proteínmi sú markery súvisiace s inými neurodegeneratívnymi ochoreniami, ako je superoxiddismutáza 1 (SOD1) súvisiaca s amyotrofickou laterálnou sklerózou (ALS) a desacharidáza súvisiaca s Parkinsonovou chorobou (PARK7). Overili sme tiež, že mnohé ďalšie markery, ako je SMOC1 a signalizačný proteín 1 na pripojenie membrány bohatý na mozog (BASP1), majú obmedzené predchádzajúce väzby na neurodegeneráciu. Stojí za zmienku, že vzhľadom na ich nízku celkovú abundanciu v CSF proteóme je pre nás ťažké použiť túto vysoko výkonnú jednorazovú detekčnú metódu na spoľahlivú detekciu MAPT a niektorých iných proteínov súvisiacich s AD (napríklad NEFL a NRGN ) (43, 44).
Potom sme skontrolovali týchto 60 prioritných panelových markerov v troch ďalších replikačných analýzach. V CSF Copy 2 sme použili jeden TMT-MS na analýzu nezávislej kohorty 297 kontrolných a AD vzoriek od Emory Goizueta ADRC (17). Replikácia CSF 3 zahŕňala opätovnú analýzu dostupných údajov TMT-MS od 120 kontrolných pacientov a pacientov s AD z Lausanne, Švajčiarsko (45). V každom súbore údajov sme zistili viac ako dve tretiny zo 60 prioritných markerov. Hoci švajčiarska štúdia používala rôzne platformy MS a metódy kvantifikácie TMT (45, 46), silne sme reprodukovali naše panelové trendy v dvoch opakovaných analýzach (obrázok 5, C a D a tabuľky S2, I a J). Na vyhodnotenie špecifickosti choroby našej skupiny sme použili TMT-MS na analýzu štvrtého súboru údajov o replikácii (replikácia CSF 4), ktorý zahŕňal nielen kontrolné (n = 18) a AD (n = 17) prípady, ale aj PD ( n = 14)), vzorky ALS (n = 18) a frontotemporálnej demencie (FTD) (n = 11) (tabuľka S1A). Úspešne sme kvantifikovali takmer dve tretiny panelových proteínov v tejto kohorte (38 zo 60). Tieto výsledky zdôrazňujú zmeny špecifické pre AD vo všetkých piatich paneloch biomarkerov (obrázok 5E a tabuľka S2K). Nárast v skupine metabolitov vykazoval najsilnejšiu AD špecificitu, po ktorej nasledovala myelinizačná a gliová skupina. V menšej miere vykazuje FTD aj nárast medzi týmito panelmi, čo môže odrážať podobné potenciálne zmeny siete (17). Na rozdiel od toho ALS a PD vykazovali takmer rovnaké profily myelinizácie, glií a metabolómov ako kontrolná skupina. Celkovo, napriek rozdielom v príprave vzoriek, platforme MS a metódam kvantifikácie TMT, tieto opakované analýzy ukazujú, že naše prioritné panelové markery majú vysoko konzistentné zmeny špecifické pre AD vo viac ako 500 jedinečných vzorkách CSF.
AD neurodegenerácia bola široko uznávaná niekoľko rokov pred nástupom kognitívnych symptómov, takže existuje naliehavá potreba biomarkerov AsymAD (5, 31). Čoraz viac dôkazov však ukazuje, že biológia AsymAD nie je ani zďaleka homogénna a komplexná interakcia rizika a odolnosti vedie k veľkým individuálnym rozdielom v následnej progresii ochorenia (47). Hoci sa hladiny základných biomarkerov CSF (Ap1-42, celkový tau a p-tau) používajú na identifikáciu prípadov AsymAD, nepreukázalo sa, že by boli schopné spoľahlivo predpovedať, kto postúpi do demencie (4, 7), čo naznačuje viac. potrebné zahrnúť holistické nástroje biomarkerov založené na viacerých aspektoch fyziológie mozgu, aby sa presne rozvrstvilo riziko tejto populácie. Preto sme následne analyzovali náš panel biomarkerov validovaných pre AD v populácii AsymAD CSF kópie 1. Týchto 31 prípadov AsymAD vykazovalo abnormálne hladiny základných biomarkerov (pomer Aβ1–42/celkový pomer tau ELISA, <5,5) a kompletnú kogníciu (priemerná MoCA, 27,1 ± 2,2) (tabuľka S1A). Okrem toho všetci jedinci s AsymAD majú klinické skóre demencie 0, čo naznačuje, že neexistuje žiadny dôkaz o poklese dennej kognitívnej alebo funkčnej výkonnosti.
Najprv sme analyzovali hladiny overených panelov vo všetkých 96 replikátoch CSF 1 vrátane kohorty AsymAD. Zistili sme, že niekoľko panelov v skupine AsymAD malo významné zmeny v hojnosti podobné AD, vaskulárny panel vykazoval klesajúci trend v AsymAD, zatiaľ čo všetky ostatné panely vykazovali vzostupný trend (obrázok 6A). Preto všetky panely vykazovali vysoko významnú koreláciu s ELISA Apl-42 a celkovými hladinami tau (obrázok 6B). Naopak, korelácia medzi skupinou a skóre MoCA je relatívne slabá. Jedným z najvýraznejších zistení z týchto analýz je veľký rozsah abundancií panelov v kohorte AsymAD. Ako je znázornené na obrázku 6A, panelová úroveň skupiny AsymAD zvyčajne prekračuje panelovú úroveň kontrolnej skupiny a AD skupiny, pričom vykazuje relatívne vysokú variabilitu. Aby sme ďalej preskúmali túto heterogenitu AsymAD, použili sme analýzu viacrozmerného škálovania (MDS) na 96 prípadov replikácie CSF 1. Analýza MDS umožňuje vizualizovať podobnosť medzi prípadmi na základe určitých premenných v súbore údajov. Pre túto zhlukovú analýzu používame iba tie overené panelové markery, ktoré majú štatisticky významnú zmenu (P <0,05, AD/kontrola) na úrovni proteómu CSF objavenia a replikácie (n = 29) (tabuľka S2L). Táto analýza vytvorila jasné priestorové zhlukovanie medzi našou kontrolou a prípadmi AD (obrázok 6C). Na rozdiel od toho, niektoré prípady AsymAD sú jasne zoskupené v kontrolnej skupine, zatiaľ čo iné sa nachádzajú v prípadoch AD. Na ďalšie preskúmanie tejto heterogenity AsymAD sme použili našu mapu MDS na definovanie dvoch skupín týchto prípadov AsymAD. Prvá skupina zahŕňala prípady AsymAD zoskupené bližšie ku kontrole (n = 19), zatiaľ čo druhá skupina bola charakterizovaná prípadmi AsymAD s profilom markerov bližšie k AD (n = 12).
(A) Úroveň expresie (z-skóre) skupiny biomarkerov CSF vo všetkých 96 vzorkách v kohorte replikácie CSF 1, vrátane AsymAD. Analýza rozptylu s Tukeyho post-korekciou sa použila na vyhodnotenie štatistickej významnosti zmien abundancie panelu. (B) Korelačná analýza hladiny panelového proteínu (z-skóre) so skóre MoCA a celkovou hladinou tau vo vzorkách ELISA Ap1-42 a CSF kópia 1. Zobrazí sa Pearsonov korelačný koeficient s príslušnou hodnotou P. (C) MDS 96 prípadov CSF kópie 1 bol založený na úrovniach hojnosti 29 validovaných panelových markerov, ktoré sa významne zmenili v súboroch údajov objavu aj CSF kópie 1 [P <0,05 AD/kontrola (CT)]. Táto analýza sa použila na rozdelenie skupiny AsymAD na kontrolné (n = 19) a AD (n = 12) podskupiny. (D) Graf sopky ukazuje rozdielnu expresiu všetkých proteínov replikácie 1 CSF s log2-násobnou zmenou (os x) vzhľadom na -log10 štatistickú hodnotu P medzi dvoma podskupinami AsymAD. Panelové biomarkery sú farebné. (E) Úroveň hojnosti replikácie CSF 1 biomarkerov selekčnej skupiny je rozdielne exprimovaná medzi podskupinami AsymAD. Na vyhodnotenie štatistickej významnosti sa použila Tukeyho post-upravená analýza rozptylu.
Skúmali sme rozdielnu proteínovú expresiu medzi týmito kontrolnými prípadmi a prípadmi AsymAD podobnými AD (obrázok 6D a tabuľka S2L). Výsledná mapa sopky ukazuje, že 14 panelových značiek sa medzi týmito dvoma skupinami výrazne zmenilo. Väčšina týchto markerov sú členmi synapsie a metabolómu. Avšak SOD1 a myristoylovaný substrát proteínkinázy C bohatý na alanín (MARCKS), ktoré sú členmi myelínových a gliových imunitných skupín, tiež patria do tejto skupiny (obrázok 6, D a E). Vaskulárny panel tiež prispel dvoma markermi, ktoré boli významne znížené v skupine AsymAD podobnej AD, vrátane AE väzbového proteínu 1 (AEBP1) a člena rodiny komplementu C9. Medzi kontrolnou a AD-podobnou podskupinou AsymAD nebol žiadny významný rozdiel v ELISA AB1-42 (P = 0,38) a p-tau (P = 0,28), ale skutočne bol významný rozdiel v celkovej hladine tau (P = 0,0031 ) (obr. S7). Existuje niekoľko panelových markerov, ktoré naznačujú, že zmeny medzi dvoma podskupinami AsymAD sú významnejšie ako celkové hladiny tau (napríklad YWHAZ, SOD1 a MDH1) (obrázok 6E). Celkovo tieto výsledky naznačujú, že náš overený panel môže obsahovať biomarkery, ktoré môžu podtypovať a stratifikovať potenciálne riziko pacientov s asymptomatickým ochorením.
Existuje naliehavá potreba systémových nástrojov biomarkerov na lepšie meranie a zacielenie rôznych patofyziológií za AD. Očakáva sa, že tieto nástroje nielen zmenia náš diagnostický rámec AD, ale tiež podporia prijatie účinných stratégií liečby špecifických pre pacienta (1, 2). Na tento účel sme aplikovali nezaujatý komplexný proteomický prístup k mozgu AD a CSF, aby sme identifikovali webové biomarkery CSF, ktoré odrážajú širokú škálu patofyziológie založenej na mozgu. Naša analýza vytvorila päť panelov biomarkerov CSF, ktoré (i) odrážajú synapsie, krvné cievy, myelín, imunitnú a metabolickú dysfunkciu; ii) preukázať silnú reprodukovateľnosť na rôznych platformách členských štátov; (iii) Ukážte progresívne zmeny špecifické pre chorobu počas skorých a neskorých štádií AD. Celkovo tieto zistenia predstavujú sľubný krok smerom k vývoju rôznorodých, spoľahlivých, webovo orientovaných nástrojov biomarkerov pre výskum AD a klinické aplikácie.
Naše výsledky demonštrujú vysoko konzervovanú organizáciu proteómu mozgovej siete AD a podporujú jeho použitie ako kotvy pre vývoj biomarkerov založený na systéme. Naša analýza ukazuje, že dva nezávislé súbory údajov TMT-MS obsahujúce mozgy AD a AsymAD majú silnú modularitu. Tieto zistenia rozširujú našu predchádzajúcu prácu a demonštrujú zachovanie výkonných modulov viac ako 2 000 mozgových tkanív z viacerých nezávislých kohort vo frontálnom, parietálnom a temporálnom kortexe (17). Táto konsenzuálna sieť odráža rôzne zmeny súvisiace s chorobami pozorované v súčasnom výskume, vrátane zvýšenia zápalových modulov bohatých na gliové bunky a zníženia modulov bohatých na neuróny. Rovnako ako súčasný výskum, aj táto rozsiahla sieť sa vyznačuje významnými modulárnymi zmenami v AsymAD, ktoré ukazujú rôzne predklinické patofyziológie (17).
Avšak v rámci tohto vysoko konzervatívneho systému založeného na systéme existuje jemnejšia biologická heterogenita, najmä medzi jednotlivcami v skorých štádiách AD. Náš panel biomarkerov je schopný zobraziť dve podskupiny v AsymAD, ktoré demonštrujú významnú rozdielnu expresiu viacerých markerov CSF. Naša skupina dokázala zdôrazniť biologické rozdiely medzi týmito dvoma podskupinami, ktoré neboli zrejmé na úrovni základných biomarkerov AD. V porovnaní s kontrolnou skupinou boli pomery Api-42/celkový tau u týchto jedincov s AsymAD abnormálne nízke. Avšak iba celkové hladiny tau boli významne odlišné medzi dvoma podskupinami AsymAD, zatiaľ čo hladiny Ap1-42 a p-tau zostali relatívne porovnateľné. Keďže vysoký tau CSF sa zdá byť lepším prediktorom kognitívnych symptómov ako hladiny Aβ1-42 (7), máme podozrenie, že dve kohorty AsymAD môžu mať rôzne riziká progresie ochorenia. Vzhľadom na obmedzenú veľkosť vzorky nášho AsymAD a nedostatok dlhodobých údajov je potrebný ďalší výskum, aby sme s istotou vyvodili tieto závery. Tieto výsledky však naznačujú, že panel CSF založený na systéme môže zvýšiť našu schopnosť efektívne stratifikovať jednotlivcov počas asymptomatického štádia ochorenia.
Celkovo naše zistenia podporujú úlohu viacerých biologických funkcií v patogenéze AD. Dysregulovaný energetický metabolizmus sa však stal hlavnou témou všetkých našich piatich overených panelov označovania. Metabolické proteíny, ako je hypoxantín-guanín fosforibozyltransferáza 1 (HPRT1) a laktátdehydrogenáza A (LDHA), sú najrobustnejšie overenými synaptickými biomarkermi, čo naznačuje, že zvýšenie AD CSF je vysoko reprodukovateľné pohlavie. Naše cievy a gliové panely obsahujú aj niekoľko markerov podieľajúcich sa na metabolizme oxidačných látok. Tieto zistenia sú v súlade s kľúčovou úlohou, ktorú zohrávajú metabolické procesy v celom mozgu, a to nielen pri uspokojení vysokej energetickej náročnosti neurónov, ale aj pri splnení vysokej energetickej náročnosti astrocytov a iných gliových buniek (17, 48). Naše výsledky podporujú rastúce dôkazy, že zmeny v redoxnom potenciáli a prerušenie energetických dráh môžu byť hlavným spojením medzi niekoľkými kľúčovými procesmi zapojenými do patogenézy AD, vrátane mitochondriálnych porúch, zápalu sprostredkovaného gliami a vaskulárneho poškodenia (49). Okrem toho biomarkery metabolickej cerebrospinálnej tekutiny obsahujú veľké množstvo rozdielne bohatých proteínov medzi našou kontrolou a podskupinami AsymAD podobnými AD, čo naznačuje, že narušenie týchto energetických a redoxných dráh môže byť kritické v predklinickom štádiu ochorenia .
Rôzne trendy panelov mozgu a mozgovomiechového moku, ktoré sme pozorovali, majú tiež zaujímavé biologické dôsledky. Synapsie a metabolómy bohaté na neuróny vykazujú znížené hladiny v mozgu AD a zvýšené množstvo cerebrospinálnej tekutiny. Vzhľadom na to, že neuróny sú bohaté na mitochondrie produkujúce energiu na synapsiách, ktoré poskytujú energiu pre ich početné špecializované signály (50), očakáva sa podobnosť profilov expresie týchto dvoch skupín neurónov. Strata neurónov a extrúzia poškodených buniek môže vysvetliť tieto trendy panelov mozgu a CSF v neskoršom ochorení, ale nemôžu vysvetliť skoré zmeny panelu, ktoré pozorujeme (13). Jedným z možných vysvetlení týchto zistení pri včasnom asymptomatickom ochorení je abnormálne synaptické prerezávanie. Nové dôkazy na myších modeloch naznačujú, že synaptická fagocytóza sprostredkovaná mikrogliami môže byť abnormálne aktivovaná pri AD a viesť k skorej strate synapsií v mozgu (51). Tento vyradený synaptický materiál sa môže hromadiť v CSF, a preto pozorujeme nárast CSF v paneli neurónov. Imunitne sprostredkované synaptické prerezávanie môže tiež čiastočne vysvetliť nárast gliových proteínov, ktoré pozorujeme v mozgu a mozgovomiechovom moku počas procesu ochorenia. Okrem synaptického prerezávania môžu celkové abnormality v exocytárnej dráhe viesť aj k rôznym expresiám neuronálnych markerov v mozgu a CSF. Množstvo štúdií ukázalo, že obsah exozómov v patogenéze AD mozgu sa zmenil (52). Extracelulárna dráha sa tiež podieľa na proliferácii Ap (53, 54). Stojí za zmienku, že potlačenie exozomálnej sekrécie môže znížiť patológiu podobnú AD v modeloch transgénnych myší AD (55).
V rovnakom čase proteín vo vaskulárnom paneli vykazoval mierne zvýšenie v mozgu AD, ale výrazne sa znížil v CSF. Dysfunkcia hematoencefalickej bariéry (BBB) môže tieto zistenia čiastočne vysvetliť. Mnohé nezávislé postmortálne štúdie na ľuďoch preukázali rozpad BBB pri AD (56, 57). Tieto štúdie potvrdili rôzne abnormálne aktivity obklopujúce túto tesne uzavretú vrstvu endotelových buniek, vrátane presakovania mozgových kapilár a perivaskulárnej akumulácie krvou prenášaných proteínov (57). To môže poskytnúť jednoduché vysvetlenie zvýšených vaskulárnych proteínov v mozgu, ale nemôže to úplne vysvetliť vyčerpanie tých istých proteínov v mozgovomiechovom moku. Jednou z možností je, že centrálny nervový systém aktívne izoluje tieto molekuly, aby vyriešil problém zvýšeného zápalu a oxidačného stresu. Zníženie niektorých najzávažnejších proteínov CSF v tomto paneli, najmä tých, ktoré sa podieľajú na regulácii lipoproteínov, súvisí s inhibíciou škodlivých úrovní zápalu a neuroprotektívnym procesom reaktívnych foriem kyslíka. To platí pre paroxonázu 1 (PON1), enzým viažuci lipoproteíny, ktorý je zodpovedný za zníženie úrovne oxidačného stresu v obehu (58, 59). Alfa-1-mikroglobulín/bikunínový prekurzor (AMBP) je ďalším signifikantne down-regulovaným markerom vaskulárnej skupiny. Je to prekurzor lipidového transportéra bikunínu, ktorý sa tiež podieľa na potlačovaní zápalu a neurologickej ochrane (60, 61).
Napriek rôznym zaujímavým hypotézam je neschopnosť priamo detegovať mechanizmy biochemických chorôb dobre známym obmedzením proteomickej analýzy založenej na objavoch. Preto je potrebný ďalší výskum, aby sme s istotou definovali mechanizmy za týmito panelmi biomarkerov. S cieľom posunúť sa smerom k rozvoju klinickej analýzy založenej na SM si budúce smerovanie vyžaduje aj použitie cielených kvantitatívnych metód na rozsiahle overenie biomarkerov, ako je selektívne alebo paralelné monitorovanie reakcií (62). Nedávno sme použili monitorovanie paralelných reakcií (63) na overenie mnohých zmien proteínov CSF, ktoré sú tu opísané. Niekoľko cieľových prioritných panelov je kvantifikovaných s významnou presnosťou, vrátane YWHAZ, ALDOA a SMOC1, ktoré mapujú naše panely synapsie, metabolizmu a zápalu (63). Na overenie cieľa môže byť užitočné aj nezávislé získavanie údajov (DIA) a iné stratégie založené na MS. Bud a kol. (64) Nedávno sa preukázalo, že medzi biomarkermi AD identifikovanými v našom súbore údajov na objavenie CSF a nezávislým súborom údajov DIA-MS, ktorý pozostáva z takmer 200 vzoriek CSF z troch rôznych európskych kohort, dochádza k významnému prekrývaniu. Tieto nedávne štúdie podporujú potenciál našich panelov premeniť sa na spoľahlivú detekciu založenú na MS. Tradičná detekcia založená na protilátkach a aptaméroch je tiež dôležitá pre ďalší vývoj kľúčových biomarkerov AD. Vzhľadom na nízku abundanciu CSF je ťažšie detegovať tieto biomarkery pomocou vysokovýkonných MS metód. NEFL a NRGN sú dva také príklady biomarkerov CSF s nízkym výskytom, ktoré sú mapované na panel v našej komplexnej analýze, ale nemožno ich spoľahlivo zistiť pomocou našej jedinej stratégie MS. Stratégie zacielenia založené na viacerých protilátkach, ako je PEA, môžu podporiť klinickú transformáciu týchto markerov.
Celkovo táto štúdia poskytuje jedinečný proteomický prístup na identifikáciu a overenie biomarkerov CSF AD založených na rôznych systémoch. Optimalizácia týchto panelov markerov v rámci ďalších kohort AD a platforiem MS sa môže ukázať ako sľubná pre pokrok v stratifikácii rizika AD a liečbe. Štúdie, ktoré hodnotia pozdĺžnu úroveň týchto panelov v priebehu času, sú tiež dôležité na určenie, ktorá kombinácia markerov najlepšie stratifikuje riziko skorého ochorenia a zmien v závažnosti ochorenia.
Okrem 3 vzoriek skopírovaných CSF boli všetky vzorky CSF použité v tejto štúdii zhromaždené pod záštitou Emory ADRC alebo blízko príbuzných výskumných inštitúcií. V týchto proteomických štúdiách boli použité celkom štyri sady vzoriek Emory CSF. Zistilo sa, že kohorta CSF obsahuje vzorky od 20 zdravých kontrol a 20 pacientov s AD. Kópia 1 CSF obsahuje vzorky od 32 zdravých kontrol, 31 jedincov s AsymAD a 33 jedincov s AD. Kópia 2 CSF obsahuje 147 kontrol a 150 vzoriek AD. Kohorta 4 replikácie CSF s viacerými chorobami zahŕňala 18 kontrol, 17 AD, 19 ALS, 13 PD a 11 FTD vzoriek. Podľa dohody schválenej Inštitucionálnou revíznou radou univerzity Emory všetci účastníci štúdie Emory získali informovaný súhlas. Podľa pokynov National Institute of Aging Best Practice Guidelines for Alzheimer's Centers z roku 2014 (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) sa cerebrospinálny mok odoberal a uchovával lumbálnou punkciou. Pacienti s kontrolou a AsymAD a AD dostali štandardizované kognitívne hodnotenie na Emory Cognitive Neurology Clinic alebo Goizueta ADRC. Ich vzorky cerebrospinálnej tekutiny boli testované pomocou INNO-BIA AlzBio3 Luminex na ELISA Ap1-42, analýzu celkového tau a p-tau (65). Hodnoty ELISA sa používajú na podporu diagnostickej klasifikácie subjektov na základe stanovených hraničných kritérií pre biomarkery AD (66, 67). Základné demografické a diagnostické údaje pre iné diagnózy CSF (FTD, ALS a PD) sa získavajú aj od Emory ADRC alebo pridružených výskumných inštitúcií. Súhrnné metadáta prípadu pre tieto prípady Emory CSF možno nájsť v tabuľke S1A. Charakteristiky švajčiarskej kohorty replikácie CSF 3 už boli publikované (45).
CSF našiel vzorku. Aby sa zväčšila hĺbka nášho objavu súboru údajov CSF, pred trypsinizáciou sa uskutočnila imunitná konzumácia proteínov s vysokým množstvom. Stručne povedané, 130 μl CSF zo 40 individuálnych vzoriek CSF a rovnaký objem (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletation Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) sa umiestnilo do rotačnej kolóny (Thermo Fisher Scientific, A89868) v miestnosti. teplota inkubovať). Po 15 minútach odstreďovania vzorku odstreďujte 2 minúty pri 1000 g. 3K ultraodstredivé filtračné zariadenie (Millipore, UFC500396) sa použilo na zahustenie vzorky odtoku odstreďovaním pri 14 000 g počas 30 minút. Všetky objemy vzoriek zrieďte na 75 μl fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom. Koncentrácia proteínu bola hodnotená metódou bicinchonínovej kyseliny (BCA) podľa protokolu výrobcu (Thermo Fisher Scientific). Imunodepletovaný CSF (60 ul) zo všetkých 40 vzoriek sa štiepil lyzyl endopeptidázou (LysC) a trypsínom. Stručne povedané, vzorka bola redukovaná a alkylovaná 1,2 μl 0,5 M tris-2(-karboxyetyl)-fosfínu a 3 μl 0,8 M chlóracetamidu pri 90 °C počas 10 minút a potom sonikovaná vo vodnom kúpeli počas 15 minút. Vzorka sa zriedila 193 ul 8 M močovinového pufra [8 M močovina a 100 mM NaHP04 (pH 8,5)] na konečnú koncentráciu 6 M močoviny. LysC (4,5 μg; Wako) sa používa na štiepenie cez noc pri teplote miestnosti. Vzorka sa potom zriedila na 1 M močovinu s 50 mM hydrogenuhličitanu amónneho (ABC) (68). Pridajte rovnaké množstvo (4,5 μg) trypsínu (Promega) a potom vzorku inkubujte 12 hodín. Roztok štiepeného peptidu sa okyslí na konečnú koncentráciu 1 % kyseliny mravčej (FA) a 0,1 % kyseliny trifluóroctovej (TFA) (66) a potom sa odsolí pomocou 50 mg kolóny Sep-Pak C18 (Waters), ako je opísané vyššie (25). . Peptid sa potom eluoval v 1 ml 50 % acetonitrilu (ACN). Na štandardizáciu kvantifikácie proteínov naprieč šaržami (25) sa spojili 100 μl alikvóty zo všetkých 40 vzoriek CSF, aby sa vytvorila zmiešaná vzorka, ktorá sa potom rozdelila do piatich vzoriek globálneho vnútorného štandardu (GIS) (48). Všetky jednotlivé vzorky a kombinované štandardy sa sušia vysokorýchlostným vákuom (Labconco).
CSF skopíruje vzorku. Dayon a kolegovia už predtým opísali imunitnú depléciu a trávenie vzoriek CSF kópie 3 (45, 46). Zostávajúce vzorky replikátu neboli jednotlivo imunodepletované. Strávte tieto neodstránené vzorky v trypsíne, ako je opísané vyššie (17). Pre každú opakovanú analýzu sa 120 ul alikvóty eluovaného peptidu z každej vzorky spojili a rozdelili na rovnaké objemové alikvóty, ktoré sa použili ako globálny vnútorný štandard značený TMT (48). Všetky jednotlivé vzorky a kombinované štandardy sa sušia vysokorýchlostným vákuom (Labconco). Aby sa zosilnil signál proteínu CSF s nízkym výskytom, spojením 125 μl z každej vzorky bola pre každú analýzu replikátu pripravená „vylepšená“ vzorka [tj biologická vzorka, ktorá napodobňuje výskumnú vzorku, ale dostupné množstvo je oveľa väčšia (37, 69)] zlúčená do zmiešanej vzorky CSF (17). Zmiešaná vzorka bola potom imunoodstránená s použitím 12 ml živice na odstránenie proteínov s vysokou selektivitou Top14 (Thermo Fisher Scientific, A36372), štiepená, ako je opísané vyššie, a zahrnutá do následného viacnásobného značenia TMT.
Čas odoslania: 27. augusta 2021