Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS. Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer). Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, vykreslíme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Termofily sú mikroorganizmy, ktorým sa darí pri vysokých teplotách. Ich štúdium môže poskytnúť cenné informácie o tom, ako sa život prispôsobuje extrémnym podmienkam. S bežnými optickými mikroskopmi je však ťažké dosiahnuť podmienky vysokej teploty. Bolo navrhnutých niekoľko domácich riešení založených na lokálnom odporovom elektrickom ohreve, ale neexistuje žiadne jednoduché komerčné riešenie. V tomto článku predstavujeme koncept ohrevu laserom v mikroskope nad zorným poľom mikroskopu, aby sa zabezpečili vysoké teploty pre termofilné štúdie pri zachovaní mierneho prostredia používateľa. Mikroúrovňové zahrievanie pri strednej intenzite lasera je možné dosiahnuť použitím zlatého substrátu potiahnutého nanočasticami ako biokompatibilného a účinného absorbéra svetla. Diskutuje sa o možných účinkoch konvekcie tekutiny v mikromeradle, retencie buniek a odstredivého termoforetického pohybu. Metóda bola demonštrovaná na dvoch druhoch: (i) Geobacillus stearothermophilus, aktívna termofilná baktéria, ktorá sa rozmnožuje pri asi 65 °C, u ktorej sme pozorovali klíčenie, rast a plávanie pri zahrievaní v mikromeradle; (ii) Thiobacillus sp., optimálne hypertermofilná archaea. pri 80°C. Táto práca otvára cestu pre jednoduché a bezpečné pozorovanie termofilných mikroorganizmov pomocou moderných a cenovo dostupných mikroskopických nástrojov.
V priebehu miliárd rokov sa život na Zemi vyvíjal, aby sa prispôsobil širokému spektru environmentálnych podmienok, ktoré sú niekedy z našej ľudskej perspektívy považované za extrémne. Najmä niektorým teplomilným mikroorganizmom (baktériám, archeám, hubám) nazývaným teplomilné sa darí v teplotnom rozmedzí od 45°C do 122°C1, 2, 3, 4. Teplomilné živočíchy žijú v rôznych ekosystémoch, ako sú hlbokomorské hydrotermálne prieduchy, horúce pramene alebo vulkanické oblasti. Ich výskum vyvolal v posledných desaťročiach veľký záujem z najmenej dvoch dôvodov. Najprv sa z nich môžeme dozvedieť napríklad to, ako sú termofily 5, 6, enzýmy 7, 8 a membrány 9 stabilné pri takých vysokých teplotách, alebo ako termofily dokážu odolávať extrémnym úrovniam žiarenia10. Po druhé, sú základom pre mnohé dôležité biotechnologické aplikácie1,11,12, ako je výroba palív13,14,15,16, chemická syntéza (dihydro, alkoholy, metán, aminokyseliny atď.)17, bioťažba18 a termostabilné biokatalyzátory7,11, 13. Najmä v súčasnosti dobre známa polymerázová reťazová reakcia (PCR)19 zahŕňa enzým (Taq polymeráza) izolovaný z termofilnej baktérie Thermus aquaticus, jedného z prvých objavených termofilov.
Štúdium termofilov však nie je ľahká úloha a nedá sa improvizovať v žiadnom biologickom laboratóriu. Najmä živé termofily nemožno pozorovať in vitro žiadnym štandardným svetelným mikroskopom, dokonca ani s komerčne dostupnými vyhrievacími komorami, ktoré sú zvyčajne dimenzované na teploty až 40 °C. Od 90. rokov 20. storočia sa len niekoľko výskumných skupín venovalo zavádzaniu systémov vysokoteplotnej mikroskopie (HTM). V roku 1994 Glukh a kol. Ohrievacia/chladiaca komora bola koncipovaná na základe použitia Peltierovho článku, ktorý riadi teplotu uzavretých pravouhlých kapilár, aby sa zachovala anaeróbnosť20. Zariadenie je možné zahriať až na 100 °C rýchlosťou 2 °C/s, čo umožňuje autorom študovať motilitu hypertermofilnej baktérie Thermotoga maritima21. V roku 1999 Horn a kol. Bolo vyvinuté veľmi podobné zariadenie, stále založené na použití vyhrievaných kapilár vhodných pre komerčnú mikroskopiu na štúdium bunkového delenia/spojenia. Po dlhom období relatívnej nečinnosti sa v roku 2012 obnovilo hľadanie efektívnych HTM, najmä v súvislosti so sériou prác skupiny Wirth, ktorá používala zariadenie vynájdené Hornom a kol. Pred 15 rokmi sa motilita veľkého počtu archeí, vrátane hypertermofilov, skúmala pri teplotách do 100 °C pomocou vyhrievaných kapilár23,24. Pôvodný mikroskop tiež upravili, aby dosiahli rýchlejšie zahrievanie (niekoľko minút namiesto 35 minút na dosiahnutie nastavenej teploty) a dosiahli lineárny teplotný gradient viac ako 2 cm naprieč médiom. Toto zariadenie na tvarovanie teplotného gradientu (TGFD) sa používa na štúdium mobility mnohých termofilov v rámci teplotných gradientov na biologicky relevantné vzdialenosti24,25.
Ohrev uzavretých kapilár nie je jediný spôsob, ako pozorovať živé termofily. V roku 2012 Kuwabara a spol. Boli použité podomácky vyrobené jednorazové pyrexové komory utesnené tepelne odolným lepidlom (Super X2; Cemedine, Japonsko). Vzorky sa umiestnili na komerčne dostupnú priehľadnú vyhrievaciu platňu (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japonsko) schopnú zahriať sa až na 110 °C, ale pôvodne nebola určená na biozobrazovanie. Autori pozorovali efektívne delenie anaeróbnych termofilných baktérií (Thermosipho globiformans, doba zdvojenia 24 min) pri 65°C. V roku 2020 Pulshen a spol. Efektívny ohrev komerčných kovových riadov (AttofluorTM, Thermofisher) bol demonštrovaný pomocou dvoch domácich vykurovacích prvkov: veka a stolíka (konfigurácia inšpirovaná strojom PCR). Toto spojenie vedie k rovnomernej teplote kvapaliny a zabraňuje vyparovaniu a kondenzácii na dne veka. Použitie O-krúžku zabraňuje výmene plynu s prostredím. Tento HTM, nazývaný sulfoskop, bol použitý na zobrazenie Sulfolobus acidocaldarius pri 75 °C27.
Uznaným obmedzením všetkých týchto systémov bolo obmedzenie používania vzduchových objektívov, pričom akékoľvek ponorenie do oleja nie je vhodné na takú vysokú teplotu a na zobrazovanie cez priehľadné vzorky s hrúbkou > 1 mm. Uznaným obmedzením všetkých týchto systémov bolo obmedzenie používania vzduchových objektívov, pričom akékoľvek ponorenie do oleja nie je vhodné na takú vysokú teplotu a na zobrazovanie cez priehľadné vzorky s hrúbkou > 1 mm. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использованиовие поскольку любое иммерсионное погружение в масло не подходило для такой высемой ализации через прозрачные образцы толщиной > 1 мм. Rozpoznaným nedostatkom všetkých týchto systémov bolo obmedzenie na použitie vzduchových objektívov, pretože akákoľvek olejová imerzia nebola vhodná pre takú vysokú teplotu a na vizualizáciu cez priehľadné vzorky s hrúbkou > 1 mm.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜 ， 任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1 毫米厚的透明样品成像。 Uznávaným obmedzením všetkých týchto systémov je obmedzenie použitia zrkadla s prúdením vzduchu, pretože olejová imerzia nie je vhodná na zobrazovanie priehľadných vzoriek s hrúbkou > 1 mm pri takých vysokých teplotách. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниче ппование вполоз п ark ружение в масло непригодно для таких ысоких температур и и иуализацарез прозрачрачрачрачрачрачрачрачрачрачрачрачрачрачрачрачрачрачрачрачрачрачрачрачраче ое оче оные оче оче оче оче оче о dokáza Uznanou nevýhodou všetkých týchto systémov je obmedzené použitie vzduchových šošoviek, akékoľvek ponorenie do oleja je nevhodné pre také vysoké teploty a vizualizáciu cez priehľadné vzorky s hrúbkou > 1 mm.Nedávno toto obmedzenie zrušili Charles-Orzag et al. 28, ktorý vyvinul zariadenie, ktoré už neposkytuje teplo okolo záujmového systému, ale skôr vo vnútri samotného krycieho skla, pokrytého tenkou priehľadnou vrstvou rezistora z ITO (oxid indium-cín). Viečko je možné zohriať až na 75 °C prechodom elektrického prúdu cez priehľadnú vrstvu. Autor však musí šošovku k objektívu aj zahriať, maximálne však na 65 °C, aby ju nepoškodil.
Tieto práce ukazujú, že vývoj efektívnej vysokoteplotnej optickej mikroskopie nebol široko prijatý, často si vyžaduje domáce vybavenie a často sa dosahuje za cenu priestorového rozlíšenia, čo je vážna nevýhoda vzhľadom na to, že termofilné mikroorganizmy nie sú väčšie ako niekoľko mikrometre. Znížený objem ohrevu je kľúčom k riešeniu troch základných problémov HTM: slabé priestorové rozlíšenie, vysoká tepelná zotrvačnosť pri zahrievaní systému a škodlivé zahrievanie okolitých prvkov (imerzný olej, šošovka objektívu... alebo ruky používateľa) pri extrémnych teplotách. ).
V tomto článku uvádzame HTM pre termofilné pozorovanie, ktoré nie je založené na odporovom ohreve. Namiesto toho sme dosiahli lokalizované zahrievanie v obmedzenej oblasti zorného poľa mikroskopu laserovým ožiarením substrátu absorbujúceho svetlo. Rozloženie teploty bolo vizualizované pomocou kvantitatívnej fázovej mikroskopie (QPM). Účinnosť tejto metódy demonštruje Geobacillus stearothermophilus, pohyblivá termofilná baktéria, ktorá sa rozmnožuje pri teplote asi 65 °C a má krátky čas zdvojenia (asi 20 minút), a Sulfolobus shibatae, hypertermofil, ktorý optimálne rastie pri teplote 80 °C (archaea). na ilustráciu. Normálna rýchlosť replikácie a plávanie boli pozorované ako funkcia teploty. Tento laser HTM (LA-HTM) nie je obmedzený hrúbkou krycieho sklíčka ani povahou objektívu (vzduchová alebo olejová imerzia). To umožňuje použitie akéhokoľvek objektívu s vysokým rozlíšením na trhu. Netrpí ani pomalým zahrievaním v dôsledku tepelnej zotrvačnosti (dosahuje okamžité zahrievanie v milisekundovom meradle) a používa iba komerčne dostupné komponenty. Jediné nové bezpečnostné obavy súvisia s prítomnosťou silných laserových lúčov (zvyčajne do 100 mW) vo vnútri zariadenia a možno aj cez oči, ktoré vyžadujú ochranné okuliare.
Princíp LA-HTM spočíva v použití lasera na lokálne zahrievanie vzorky v zornom poli mikroskopu (obr. 1a). Na to musí vzorka absorbovať svetlo. Aby sme použili primeraný výkon lasera (menej ako 100 mW), nespoliehali sme sa na absorpciu svetla tekutým médiom, ale umelo sme zvýšili absorpciu vzorky potiahnutím substrátu nanočasticami zlata (obr. 1c). Zahrievanie nanočastíc zlata svetlom má zásadný význam pre oblasť tepelnej plazmoniky s očakávanými aplikáciami v biomedicíne, nanochémii alebo pri zbere slnečného žiarenia29,30,31. Počas niekoľkých posledných rokov sme tento LA-HTM použili v niekoľkých štúdiách týkajúcich sa aplikácií tepelnej plazmy vo fyzike, chémii a biológii. Hlavným problémom tejto metódy je zobrazenie konečného teplotného profilu, pretože zvýšená teplota je obmedzená na oblasť mikroskopu vo vzorke. Ukázali sme, že teplotné mapovanie je možné dosiahnuť pomocou štvorvlnového interferometra s priečnym šmykom, čo je jednoduchá a veľmi citlivá metóda kvantitatívnej fázovej mikroskopie s vysokým rozlíšením založená na použití dvojrozmerných difrakčných mriežok (známych aj ako krížové mriežky). 33,34,35,36. Spoľahlivosť tejto techniky tepelnej mikroskopie, založenej na vlnoplochovej mikroskopii s prekríženou mriežkou (CGM), bola preukázaná v desiatkach článkov publikovaných za posledné desaťročie37,38,39,40,41,42,43.
Schéma inštalácie paralelného laserového vyhrievacieho, tvarovacieho a teplotného mikroskopu. b Geometria vzorky pozostávajúca z komory AttofluorTM obsahujúcej krycie sklíčko potiahnuté nanočasticami zlata. c Pozrite sa pozorne na vzorku (nie v mierke). d predstavuje rovnomerný profil laserového lúča a (e) simulované následné rozloženie teploty na rovine vzorky zlatých nanočastíc. f je prstencový profil laserového lúča vhodný na generovanie rovnomernej teploty, ako je znázornené v simulácii výslednej distribúcie teploty znázornenej na (g). Mierka: 30 µm.
Predovšetkým sme nedávno dosiahli zahrievanie buniek cicavcov pomocou LA-HTM a CGM a sledovali sme reakcie bunkového tepelného šoku v rozsahu 37-42 °C, čím sme demonštrovali použiteľnosť tejto techniky na zobrazovanie jednotlivých živých buniek. Aplikácia LA-HTM na štúdium mikroorganizmov pri vysokých teplotách však nie je jednoznačná, pretože si vyžaduje väčšiu opatrnosť v porovnaní s bunkami cicavcov: po prvé, zahriatie dna média o desiatky stupňov (a nie o niekoľko stupňov) vedie k na silný vertikálny teplotný gradient. môže vytvárať prúdenie tekutiny 44, ktoré, ak nie je pevne pripojené k substrátu, môže spôsobiť nežiaduci pohyb a miešanie baktérií. Táto konvekcia môže byť eliminovaná znížením hrúbky vrstvy kvapaliny. Na tento účel sa vo všetkých experimentoch uvedených nižšie umiestnili bakteriálne suspenzie medzi dve krycie sklíčka s hrúbkou približne 15 um umiestnené vo vnútri kovovej misky (AttofluorTM, Thermofisher, obr. 1b,c). V zásade je možné vyhnúť sa konvekcii, ak je hrúbka kvapaliny menšia ako veľkosť lúča vyhrievacieho lasera. Po druhé, práca v takejto obmedzenej geometrii môže udusiť aeróbne organizmy (pozri obr. S2). Tomuto problému možno predísť použitím substrátu, ktorý je priepustný pre kyslík (alebo akýkoľvek iný životne dôležitý plyn), ponechaním zachytených vzduchových bublín vo vnútri krycieho sklíčka alebo vyvŕtaním otvorov do horného krycieho sklíčka (pozri obr. S1) 45 . V tejto štúdii sme zvolili posledné riešenie (obrázky 1b a S1). Nakoniec, laserový ohrev neposkytuje rovnomerné rozloženie teploty. Ani pri rovnakej intenzite laserového lúča (obr. 1d) nie je rozloženie teploty rovnomerné, ale skôr pripomína Gaussovo rozloženie v dôsledku tepelnej difúzie (obr. 1e). Keď je cieľom stanoviť presné teploty v zornom poli na štúdium biologických systémov, nerovnomerné profily nie sú ideálne a môžu viesť aj k termoforetickému pohybu baktérií, ak nepriľnú k substrátu (pozri obr. S3, S4)39. Na tento účel sme použili modulátor priestorového svetla (SLM) na tvarovanie infračerveného laserového lúča podľa tvaru prstenca (obr. 1f) v rovine vzorky, aby sme dosiahli dokonale rovnomerné rozloženie teploty v rámci danej geometrickej oblasti, napriek tepelnej difúzii (obr. 1d) 39, 42, 46. Umiestnite horné krycie sklíčko na kovovú misku (obrázok 1b), aby ste zabránili vyparovaniu média, a pozorujte aspoň niekoľko dní. Pretože toto horné krycie sklíčko nie je utesnené, v prípade potreby je možné kedykoľvek jednoducho pridať ďalšie médium.
Aby sme ilustrovali, ako LA-HTM funguje a demonštrovali jeho použiteľnosť v termofilnom výskume, študovali sme aeróbne baktérie Geobacillus stearothermophilus, ktoré majú optimálnu teplotu rastu okolo 60-65°C. Baktéria má tiež bičíky a schopnosť plávať, čo poskytuje ďalší indikátor normálnej bunkovej aktivity.
Vzorky (obr. 1b) sa vopred inkubovali pri 60 °C počas jednej hodiny a potom sa umiestnili do držiaka vzoriek LA-HTM. Táto predinkubácia je voliteľná, ale stále užitočná z dvoch dôvodov: Po prvé, keď je laser zapnutý, bunky okamžite rastú a delia sa (pozri film M1 v Doplnkových materiáloch). Bez predinkubácie sa rast baktérií zvyčajne oneskorí o približne 40 minút vždy, keď sa na vzorke zahreje nová pozorovacia plocha. Po druhé, 1 hodinová predinkubácia podporila adhéziu baktérií na krycie sklíčko, čím sa zabránilo vychýleniu buniek z zorného poľa v dôsledku termoforézy, keď bol laser zapnutý (pozri film M2 v doplnkových materiáloch). Termoforéza je pohyb častíc alebo molekúl pozdĺž teplotného gradientu, zvyčajne z horúceho do studeného, a baktérie nie sú výnimkou43,47. Tento nežiaduci efekt je na danej ploche eliminovaný použitím SLM na tvarovanie laserového lúča a dosiahnutie rovnomerného rozloženia teploty.
Na obr. Obrázok 2 ukazuje distribúciu teploty nameranú pomocou CGM získanú ožiarením skleneného substrátu potiahnutého nanočasticami zlata prstencovým laserovým lúčom (obr. 1f). Po celej ploche pokrytej laserovým lúčom bolo pozorované ploché rozloženie teploty. Táto zóna bola nastavená na 65 °C, čo je optimálna teplota rastu. Mimo tejto oblasti teplotná krivka prirodzene klesá na \(1/r\) (kde \(r\) je radiálna súradnica).
Teplotná mapa meraní CGM získaná použitím prstencového laserového lúča na ožiarenie vrstvy nanočastíc zlata, aby sa získal plochý teplotný profil na kruhovej ploche. b Izoterma teplotnej mapy (a). Obrys laserového lúča predstavuje sivý bodkovaný kruh. Experiment sa opakoval dvakrát (pozri doplnkové materiály, obrázok S4).
Životaschopnosť bakteriálnych buniek sa monitorovala niekoľko hodín pomocou LA-HTM. Na obr. 3 zobrazuje časový interval pre štyri snímky zhotovené z 3-hodinového 20-minútového filmu (Film M3, Doplnkové informácie). Pozorovalo sa, že baktérie sa aktívne množili v kruhovej oblasti definovanej laserom, kde bola teplota optimálna a blížila sa k 65 °C. Naopak, rast buniek bol výrazne znížený, keď teplota klesla pod 50 °C na 10 s.
Obrazy optickej hĺbky baktérií G. stearothermophilus rastúcich po laserovom zahrievaní v rôznych časoch, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, mimo 200 Extrahované z jednominútového filmu (film M3 uvedený v doplnkových informáciách) prekrytého na zodpovedajúcej teplotnej mape. Laser sa zapne v čase \(t=0\). Do obrazu intenzity boli pridané izotermy.
Pre ďalšiu kvantifikáciu bunkového rastu a jeho závislosti od teploty sme merali nárast biomasy rôznych kolónií pôvodne izolovaných baktérií v zornom poli Movie M3 (obr. 4). Rodičovské baktérie vybrané na začiatku tvorby mini kolónie tvoriacej jednotky (mCFU) sú znázornené na obrázku S6. Merania suchej hmotnosti sa uskutočnili kamerou CGM 48, ktorá sa použila na mapovanie distribúcie teploty. Schopnosť CGM merať suchú hmotnosť a teplotu je silnou stránkou LA-HTM. Ako sa očakávalo, vysoká teplota spôsobila rýchlejší rast baktérií (obr. 4a). Ako ukazuje semilogaritmický graf na obr. 4b, rast pri všetkých teplotách nasleduje exponenciálny rast, kde údaje používajú exponenciálnu funkciu \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau}+ {{ \mbox{cst}}}\), kde \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – čas generovania (alebo čas zdvojnásobenia), \( g =1/ \tau\) – rýchlosť rastu (počet dielikov za jednotku času). Na obr. 4c znázorňuje príslušnú rýchlosť rastu a dobu generovania ako funkciu teploty. Rýchlo rastúce mCFU sú charakterizované saturáciou rastu po dvoch hodinách, čo je očakávané správanie v dôsledku vysokej hustoty baktérií (podobne ako stacionárna fáza v klasických tekutých kultúrach). Celkový tvar \(g\left(T\right)\) (obr. 4c) zodpovedá očakávanej dvojfázovej krivke pre G. stearothermophilus s optimálnou rýchlosťou rastu okolo 60-65°C. Porovnajte údaje pomocou základného modelu (obrázok S5)49, kde \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, čo dobre súhlasí s inými hodnotami citovanými v literatúre49. Hoci parametre závislé od teploty sú reprodukovateľné, maximálna rýchlosť rastu \({G}_{0}\) sa môže líšiť od jedného experimentu k druhému (pozri obrázky S7-S9 a film M4). Na rozdiel od parametrov prispôsobenia teploty, ktoré by mali byť univerzálne, maximálna rýchlosť rastu závisí od vlastností média (dostupnosť živín, koncentrácia kyslíka) v rámci pozorovanej geometrie v mikroskope.
a Mikrobiálny rast pri rôznych teplotách. mCFU: Miniatúrne jednotky tvoriace kolónie. Údaje získané z videa jednej baktérie rastúcej v teplotnom gradiente (film M3). b Rovnaké ako (a), semilogaritmická stupnica. c Rýchlosť rastu\(\tau\) a generačný čas\(g\) vypočítané z lineárnej regresie (b). Horizontálne chybové úsečky: teplotný rozsah, v ktorom sa mCFU rozšírili do zorného poľa počas rastu. Vertikálne chybové úsečky: štandardná chyba lineárnej regresie.
Okrem normálneho rastu sa niektoré baktérie niekedy vznášali počas zahrievania laserom, čo je očakávané správanie pre baktérie s bičíkmi. Film M5 v dodatočných informáciách ukazuje takéto plavecké aktivity. V tomto experimente sa na vytvorenie teplotného gradientu použilo rovnomerné laserové žiarenie, ako je znázornené na obrázkoch 1d, e a S3. Obrázok 5 ukazuje dve obrazové sekvencie vybrané z filmu M5, ktoré ukazujú, že jedna baktéria vykazuje smerový pohyb, zatiaľ čo všetky ostatné baktérie zostávajú nehybné.
Dva časové rámce (a) a (b) ukazujú plávanie dvoch rôznych baktérií označených bodkovanými kruhmi. Obrázky boli extrahované z filmu M5 (poskytnutého ako doplnkový materiál).
V prípade G. stearothermophilus sa aktívny pohyb baktérií (obr. 5) začal niekoľko sekúnd po zapnutí laserového lúča. Toto pozorovanie zdôrazňuje dočasnú reakciu tohto termofilného mikroorganizmu na zvýšenie teploty, ako už pozoroval Mora et al. 24. Tému bakteriálnej motility a dokonca termotaxie možno ďalej skúmať pomocou LA-HTM.
Mikrobiálne plávanie by sa nemalo zamieňať s inými typmi fyzického pohybu, menovite (i) Brownov pohyb, ktorý sa javí ako chaotický pohyb bez určitého smeru, (ii) konvekcia 50 a termoforéza 43, spočívajúce v pravidelnom posune pohybu pozdĺž teploty. gradient.
G. stearothermophilus je známy svojou schopnosťou produkovať vysoko odolné spóry (tvorba spór), keď sú vystavené nepriaznivým podmienkam prostredia ako obrana. Keď sa podmienky prostredia opäť stanú priaznivými, spóry vyklíčia, vytvoria živé bunky a obnovia rast. Hoci je tento sporulačný/klíčiaci proces dobre známy, nikdy nebol pozorovaný v reálnom čase. Pomocou LA-HTM tu uvádzame prvé pozorovanie udalostí klíčenia u G. stearothermophilus.
Na obr. 6a ukazuje časozberné snímky optickej hĺbky (OT) získané použitím CGM sady 13 spór. Za celý čas zberu (15 h 6 min, \(t=0\) – začiatok laserového zahrievania) vyklíčili 4 z 13 spór v po sebe nasledujúcich časových bodoch \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' a \(11\) h \(30\)'. Hoci iba jedna z týchto udalostí je znázornená na obrázku 6, vo filme M6 v doplnkovom materiáli možno pozorovať 4 udalosti klíčenia. Je zaujímavé, že klíčenie sa zdá byť náhodné: nie všetky spóry vyklíčia a nevyklíčia súčasne, napriek rovnakým zmenám podmienok prostredia.
časozber pozostávajúci z 8 snímok OT (olejová imerzia, 60x, objektív 1,25 NA) a (b) vývoj biomasy agregátov G. stearothermophilus. c (b) Nakreslené na semilogaritmickej stupnici na zvýraznenie linearity rýchlosti rastu (prerušovaná čiara).
Na obr. 6b,c ukazuje biomasu bunkových populácií v zornom poli ako funkciu času počas celého obdobia zberu dát. Rýchly rozpad suchej hmoty pozorovaný pri \(t=5\)h na obr. 6b, c, v dôsledku výstupu niektorých buniek zo zorného poľa. Miera rastu týchto štyroch udalostí je \(0,77\pm 0,1\) h-1. Táto hodnota je vyššia ako rýchlosť rastu spojená s obrázkom 3. 3 a 4, kde bunky rastú normálne. Dôvod zvýšenej rýchlosti rastu G. stearothermophilus zo spór je nejasný, ale tieto merania zdôrazňujú záujem LA-HTM a pracujú na úrovni jednej bunky (alebo na úrovni jednej mCFU), aby sa dozvedeli viac o dynamike života buniek .
Aby sme ďalej demonštrovali všestrannosť LA-HTM a jeho výkon pri vysokých teplotách, skúmali sme rast Sulfolobus shibatae, hypertermofilnej acidofilnej archaea s optimálnou teplotou rastu 80 °C51. V porovnaní s G. stearothermophilus majú tieto archaea tiež veľmi odlišnú morfológiu, pripomínajúc skôr 1 mikrónové guľôčky (koky) než predĺžené tyčinky (bacily).
Obrázok 7a pozostáva zo sekvenčných obrazov optickej hĺbky mCFU S. shibatae získaných pomocou CGM (pozri celovečerný film M7 v doplnkových materiáloch). Tento mCFU rastie pri teplote okolo 73 °C, pod optimálnou teplotou 80 °C, ale v teplotnom rozsahu pre aktívny rast. Pozorovali sme viaceré štiepne udalosti, vďaka ktorým mCFU po niekoľkých hodinách vyzerali ako mikrohrozny archaea. Z týchto OT obrázkov sa v priebehu času merala biomasa mCFU a uvádza sa na obrázku 7b. Je zaujímavé, že mCFU S. shibatae vykazovali skôr lineárny rast než exponenciálny rast pozorovaný u mCFU G. stearothermophilus. O povahe rýchlosti rastu buniek sa vedie dlhodobá diskusia52: zatiaľ čo niektoré štúdie uvádzajú rýchlosti rastu mikróbov, ktoré sú úmerné ich veľkosti (exponenciálny rast), iné vykazujú konštantnú rýchlosť (lineárny alebo bilineárny rast). Ako vysvetlili Tzur et al.53, rozlišovanie medzi exponenciálnym a (bi)lineárnym rastom si vyžaduje presnosť <6 % v meraniach biomasy, čo je pre väčšinu techník QPM, dokonca aj s interferometriou, nedostupné. Ako vysvetlili Tzur et al.53, rozlišovanie medzi exponenciálnym a (bi)lineárnym rastom si vyžaduje presnosť <6 % v meraniach biomasy, čo je pre väčšinu techník QPM, dokonca aj s interferometriou, nedostupné. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного ростиетретре рениях биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, даже с интрольиерезо. Ako vysvetlili Zur et al.53, rozlišovanie medzi exponenciálnym a (bi)lineárnym rastom si vyžaduje <6% presnosť meraní biomasy, čo je pre väčšinu metód QPM nedosiahnuteľné, dokonca ani pri použití interferometrie.Ako vysvetlili Zur a kol. 53, rozlišovanie medzi exponenciálnym a (bi)lineárnym rastom vyžaduje menej ako 6% presnosť meraní biomasy, čo je pre väčšinu metód QPM nedosiahnuteľné, aj keď sa používa interferometria. CGM dosahuje túto presnosť s presnosťou sub-pg pri meraniach biomasy36,48.
časozber pozostávajúci zo 6 snímok OT (olejová imerzia, 60x, objektív NA 1,25) a (b) vývoj biomasy mikro-CFU meraný pomocou CGM. Viac informácií nájdete vo filme M7.
Dokonale lineárny rast S. shibatae bol neočakávaný a ešte nebol hlásený. Očakáva sa však exponenciálny rast, prinajmenšom preto, že časom musí dôjsť k viacnásobným deleniam 2, 4, 8, 16 ... buniek. Predpokladali sme, že lineárny rast môže byť spôsobený inhibíciou buniek v dôsledku hustého balenia buniek, rovnako ako sa rast buniek spomaľuje a nakoniec dosiahne pokojný stav, keď je hustota buniek príliš vysoká.
Na záver postupne diskutujeme o nasledujúcich piatich bodoch záujmu: zníženie objemu ohrevu, zníženie tepelnej zotrvačnosti, záujem o nanočastice zlata, záujem o kvantitatívnu fázovú mikroskopiu a možný teplotný rozsah, v ktorom možno použiť LA-HTM.
V porovnaní s odporovým ohrevom ponúka laserový ohrev používaný na vývoj HTM niekoľko výhod, ktoré ilustrujeme v tejto štúdii. Najmä v kvapalných médiách v zornom poli mikroskopu sa zahrievací objem udržiava v rozmedzí niekoľkých (10 μm) 3 objemov. Týmto spôsobom sú aktívne iba pozorované mikróby, zatiaľ čo ostatné baktérie sú nečinné a môžu sa použiť na ďalšie štúdium vzorky – nie je potrebné meniť vzorku vždy, keď je potrebné skontrolovať novú teplotu. Okrem toho ohrev v mikromeradle umožňuje priame skúmanie veľkého rozsahu teplôt: Obrázok 4c bol získaný z 3-hodinového filmu (Movie M3), ktorý zvyčajne vyžaduje prípravu a vyšetrenie niekoľkých vzoriek – jednej pre každú zo skúmaných vzoriek. y je teplota predstavujúca počet dní v experimente. Zníženie vyhrievaného objemu tiež udržuje všetky okolité optické komponenty mikroskopu, najmä šošovku objektívu, pri izbovej teplote, čo bol doteraz veľký problém, ktorému komunita čelila. LA-HTM je možné použiť s akýmkoľvek objektívom, vrátane šošoviek s olejovou imerziou, a zostane pri izbovej teplote aj pri extrémnych teplotách v zornom poli. Hlavným obmedzením metódy laserového ohrevu, ktoré uvádzame v tejto štúdii, je to, že bunky, ktoré nepriľnú alebo sa vznášajú, môžu byť ďaleko od zorného poľa a ťažko sa študujú. Riešením by mohlo byť použitie šošoviek s nízkym zväčšením na dosiahnutie väčšieho nárastu teploty presahujúceho niekoľko stoviek mikrónov. Táto opatrnosť je sprevádzaná poklesom priestorového rozlíšenia, ale ak je cieľom študovať pohyb mikroorganizmov, vysoké priestorové rozlíšenie nie je potrebné.
Časový rozsah ohrevu (a chladenia) systému \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) závisí od jeho veľkosti, podľa zákona \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), kde \ (L\ ) je charakteristická veľkosť zdroja tepla (priemer laserového lúča v našej štúdii je \(L\ asi 100\) μm), \(D\) je tepelná difúznosť prostredia (priemer v našom puzdro, sklo a voda Rýchlosť difúzie\(D\ asi 2\násobok {10}^{-7}\) m2/s. Preto sú v tejto štúdii časové odozvy rádovo 50 ms, tj kvázi-okamžité). Tento okamžitý nárast teploty nielen skracuje trvanie experimentu, ale umožňuje aj presné načasovanie \(t=0\) pre akúkoľvek dynamickú štúdiu účinkov teploty.
Nami navrhovaná metóda je použiteľná pre akýkoľvek substrát absorbujúci svetlo (napríklad komerčné vzorky s ITO povlakom). Nanočastice zlata sú však schopné poskytnúť vysokú absorpciu v infračervenom pásme a nízku absorpciu vo viditeľnom rozsahu, pričom posledné uvedené charakteristiky sú zaujímavé pre efektívne optické pozorovanie vo viditeľnom rozsahu, najmä pri použití fluorescencie. Okrem toho je zlato biokompatibilné, chemicky inertné, optickú hustotu možno nastaviť od 530 nm do blízkej infračervenej oblasti a príprava vzorky je jednoduchá a ekonomická29.
Mikroskopia čela vlny s priečnou mriežkou (CGM) umožňuje nielen mapovanie teploty v mikromeradle, ale aj monitorovanie biomasy, vďaka čomu je obzvlášť užitočná (ak nie je nevyhnutná) v kombinácii s LA-HTM. Počas posledného desaťročia boli vyvinuté ďalšie techniky teplotnej mikroskopie, najmä v oblasti biozobrazovania, a väčšina z nich vyžaduje použitie fluorescenčných sond citlivých na teplotu54,55. Tieto metódy však boli kritizované a niektoré správy merali nereálne zmeny teploty v bunkách, pravdepodobne kvôli skutočnosti, že fluorescencia závisí od mnohých iných faktorov ako je teplota. Navyše väčšina fluorescenčných sond je pri vysokých teplotách nestabilná. Preto QPM a najmä CGM predstavujú ideálnu techniku teplotnej mikroskopie na štúdium života pri vysokých teplotách pomocou optickej mikroskopie.
Štúdie S. shibatae, ktoré žijú optimálne pri 80°C, ukazujú, že LA-HTM možno použiť na štúdium hypertermofilov, nielen jednoduchých termofilov. V zásade neexistuje žiadny limit na rozsah teplôt, ktoré možno dosiahnuť pomocou LA-HTM, a dokonca aj teploty nad 100 °C možno dosiahnuť pri atmosférickom tlaku bez varu, ako to demonštrovala naša skupina 38 v aplikáciách hydrotermálnej chémie pri atmosférickom tlaku. tlak A. Na ohrev nanočastíc zlata 40 sa rovnakým spôsobom používa laser. LA-HTM má teda potenciál byť použitý na pozorovanie bezprecedentných hypertermofilov štandardnou optickou mikroskopiou s vysokým rozlíšením za štandardných podmienok (tj pri environmentálnom strese).
Všetky experimenty boli uskutočnené s použitím domáceho mikroskopu, vrátane Köhlerovho osvetlenia (s LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), držiaka preparátov s manuálnym xy pohybom, objektívov (Olympus, 60x, 0,7 NA, vzduch, LUCPlanFLN60X alebo 60x, 1,25 NA, Oil , UPLFLN60XOI), kamera CGM (krížová mriežka QLSI, rozstup 39 µm, 0,87 mm od kamerového senzora Andor Zyla) na poskytovanie intenzity a vlnoplochového zobrazovania a kamera sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, 16-bitový režim, od Hamamatsu) na zaznamenávanie údaje uvedené na obrázku 5 (bakteriálne plávanie). Dichroický rozdeľovač lúčov je 749 nm BrightLine edge (Semrock, FF749-SDi01). Filter na prednej strane fotoaparátu je 694-krát krátky (FF02-694/SP-25, Semrock). Titánový zafírový laser (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pumpovaná laserová dutina tsunami, Spectra-Physics na obr. 2-5, ďalej nahradená Millenia laserom, Spectraphysics 10 W, pumpovaná laserová dutina Mira, Coherent, pre obr. 2 -5). 6 a 7) sú nastavené na vlnovú dĺžku \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, čo zodpovedá plazmónovému rezonančnému spektru nanočastíc zlata. Modulátory priestorového svetla (1920 × 1152 pixelov) boli zakúpené od Meadowlark Optics. Hologramy boli vypočítané pomocou Gerchberg-Saxtonovho algoritmu, ako je opísané v odkaze 39.
Vlnová mikroskopia s krížovou mriežkou (CGM) je optická mikroskopická technika založená na kombinácii dvojrozmernej difrakčnej mriežky (známej aj ako krížová mriežka) vo vzdialenosti jeden milimeter od snímača bežného fotoaparátu. Najbežnejší príklad CGM, ktorý sme použili v tejto štúdii, sa nazýva interferometer s priečnym posunom štyroch vlnových dĺžok (QLSI), kde krížová mriežka pozostáva zo šachovnicového vzoru intenzity/fázy zavedeného a patentovaného Primotom a kol. v roku 200034. Vertikálne a horizontálne čiary mriežky vytvárajú na snímači tiene podobné mriežke, ktorých skreslenie možno numericky spracovať v reálnom čase, aby sa získalo optické skreslenie čela vlny (alebo ekvivalentný fázový profil) dopadajúceho svetla. Pri použití na mikroskope môže kamera CGM zobraziť rozdiel optickej dráhy zobrazovaného objektu, známy aj ako optická hĺbka (OT), s citlivosťou rádovo v nanometroch36. Pri akomkoľvek meraní CGM, aby sa eliminovali akékoľvek defekty v optických komponentoch alebo lúčoch, musí byť urobený primárny referenčný OT obrázok a odčítaný od všetkých nasledujúcich obrázkov.
Teplotná mikroskopia sa uskutočnila pomocou CGM kamery, ako je opísané v odkaze. 32. Stručne povedané, zahrievanie kvapaliny mení jej index lomu a vytvára efekt tepelnej šošovky, ktorý skresľuje dopadajúci lúč. Toto skreslenie čela vlny sa meria pomocou CGM a spracováva sa pomocou dekonvolučného algoritmu, aby sa získala trojrozmerná distribúcia teploty v kvapalnom médiu. Ak sú zlaté nanočastice rovnomerne rozložené vo vzorke, je možné vykonať teplotné mapovanie v oblastiach bez baktérií, aby sa vytvorili lepšie obrázky, čo niekedy robíme. Referenčný CGM obraz bol získaný bez zahrievania (s vypnutým laserom) a následne zachytený na rovnakom mieste v obraze so zapnutým laserom.
Meranie suchej hmotnosti sa dosahuje pomocou rovnakej kamery CGM, ktorá sa používa na zobrazovanie teploty. Referenčné snímky CGM sa získali rýchlym pohybom vzorky v x a y počas expozície ako prostriedok na spriemerovanie akejkoľvek nehomogenity v OT v dôsledku prítomnosti baktérií. Z OT obrázkov baktérií sa ich biomasa získala pomocou súboru obrázkov v oblastiach vybraných pomocou domáceho segmentačného algoritmu Matlabu (pozri podsekciu „Číselný kód“) podľa postupu opísaného v ref. 48. Stručne povedané, používame vzťah \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), kde \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) je obraz optickej hĺbky, \(m\) je suchá hmotnosť a \({{{{\rm{\alpha }}}}}}\) je konštanta. Vybrali sme \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, čo je typická konštanta pre živé bunky.
Krycie sklíčko s priemerom 25 mm a hrúbkou 150 μm potiahnuté zlatými nanočasticami sa umiestnilo do komory AttofluorTM (Thermofisher) s nanočasticami zlata smerom nahor. Geobacillus stearothermophilus sa pred každým dňom experimentov predkultivoval cez noc v médiu LB (200 ot./min., 60 °C). Kvapka 5 ul suspenzie G. stearothermophilus s optickou hustotou (OD) 0,3 až 0,5 sa umiestnila na krycie sklíčko s nanočasticami zlata. Potom sa na kvapku kvaplo okrúhle krycie sklíčko s priemerom 18 mm s otvorom s priemerom 5 mm v strede a do stredu otvoru sa opakovane aplikovalo 5 μl bakteriálnej suspenzie s rovnakou optickou hustotou. Jamky na krycích sklíčkach boli pripravené v súlade s postupom opísaným v ref. 45 (ďalšie informácie nájdete v časti Doplnkové informácie). Potom pridajte 1 ml média LB na krycie sklíčko, aby ste zabránili vysychaniu vrstvy kvapaliny. Posledné krycie sklíčko sa umiestni na uzavreté veko komory Attofluor™, aby sa zabránilo vyparovaniu média počas inkubácie. Na pokusy s klíčením sme použili spóry, ktoré po konvenčných pokusoch niekedy prekryli vrchné krycie sklíčko. Podobná metóda bola použitá na získanie Sulfolobus shibatae. Tri dni (200 otáčok za minútu, 75 °C) predbežnej kultivácie Thiobacillus serrata sa uskutočňovali v médiu 182 (DSMZ).
Vzorky nanočastíc zlata boli pripravené micelárnou blokovou kopolymérovou litografiou. Tento proces je podrobne opísaný v kap. 60. Stručne, micely enkapsulujúce ióny zlata boli syntetizované zmiešaním kopolyméru s HAuCl4 v toluéne. Vyčistené krycie sklíčka sa potom ponorili do roztoku a ošetrili UV žiarením v prítomnosti redukčného činidla, čím sa získali zlaté semená. Nakoniec sa zlaté semená pestovali kontaktovaním krycieho sklíčka s vodným roztokom KAuCl4 a etanolamínu počas 16 minút, čo viedlo k kváziperiodickému a veľmi jednotnému usporiadaniu nesférických nanočastíc zlata v blízkej infračervenej oblasti.
Na konverziu interferogramov na obrázky OT sme použili domáci algoritmus, ako je podrobne uvedené v odkaze. 33 a je k dispozícii ako balík Matlab v nasledujúcom verejnom úložisku: https://github.com/baffou/CGMprocess. Balík dokáže vypočítať intenzitu a OT snímky na základe zaznamenaných interferogramov (vrátane referenčných snímok) a vzdialeností kamerového poľa.
Na výpočet fázového vzoru aplikovaného na SLM na získanie daného teplotného profilu sme použili predtým vyvinutý domáci algoritmus39,42, ktorý je dostupný v nasledujúcom verejnom úložisku: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Vstupom je požadované teplotné pole, ktoré je možné nastaviť digitálne alebo cez monochromatický obrázok bmp.
Na segmentovanie buniek a meranie ich suchej hmotnosti sme použili náš algoritmus Matlab publikovaný v nasledujúcom verejnom úložisku: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Na každom obrázku musí používateľ kliknúť na požadovanú baktériu alebo mCFU, upraviť citlivosť prútika a potvrdiť výber.
Ďalšie informácie o dizajne štúdie nájdete v abstrakte Správy o výskume prírody, ktorý je prepojený s týmto článkom.
Údaje podporujúce výsledky tejto štúdie sú dostupné od príslušných autorov na základe primeranej žiadosti.
Zdrojový kód použitý v tejto štúdii je podrobne uvedený v časti Metódy a verzie ladenia si môžete stiahnuť z https://github.com/baffou/ v nasledujúcich úložiskách: SLM_temperatureShaping, CGMprocess a CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Pohľad na termofily a ich širokospektrálne aplikácie. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Pohľad na termofily a ich širokospektrálne aplikácie.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. a Sharma, AK Prehľad termofilov a ich široké uplatnenie. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. a Sharma AK Hlboké pochopenie termofilov a široké spektrum aplikácií.3 Biotechnológia 6, 81 (2016).
Čas odoslania: 26. septembra 2022